猪肉是中国人的主要肉食之一，也深受世界各地人们的青睐，所以猪的健康和猪肉的质量直接关系着人类的健康。研究发现，猪体内的疾病、寄生虫和病毒最容易向人体内转移[1-2]，而猪圈的环境及猪圈发酵床的干湿程度，与猪的健康关系密切。潮湿发酵床和潮湿的生活环境导致细菌滋生迅速，容易引起腐蹄病；圈舍的空气不流通，氨气过浓，可加重猪呼吸道疾病的发生[3-6]。对猪圈发酵床进行微生物检测，了解发酵床中细菌种类，对于预防和控制病原菌的传播有指导作用。本实验对猪圈使用2个月发酵床的上层垫料进行细菌的分离和检测，并对其特性进行相关研究，以期为猪圈发酵床中微生物的鉴定及抑菌对策提供理论依据。

OA学术资源的利用主要包括外部环境上的政策规划、指导以及内部管理上的资源收录、揭示、组织、宣传与维护等方面，考虑到军队网络安全保密管理的特殊性，结合军队院校科研实际，本文从宏观上总部统一规划、分工协调、资金保障与微观上各馆立足实际、借鉴经验、优化利用两方面对军队院校图书馆OA学术资源利用模式进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪圈发酵床 选择中国福建省厦门市某养猪场进行标本采集，采集样本为猪圈中使用了2个月的发酵床上层5 cm的垫料。

1.1.2 试剂和材料 R2A琼脂培养基和2216(MA)琼脂培养基购买自美国BD公司，药敏纸片购买于北京天坛试剂公司，PCR仪和扫描电子显微镜由中国科学院微生物研究所公共仪器平台提供，2×EasyTaq PCR SuperMix购买于北京天根试剂有限公司。

1.2 菌株的分离与镜检

菌株的分离将猪发酵床上层垫料置于已灭菌样品瓶中，用无菌蒸馏水10倍稀释[7]。R2A培养基作为分离菌株培养基，配制R2A培养基121 ℃灭菌15 min，倒入平板中备用。用无菌枪吸取10 μL稀释液样品直接打入培养基平板上，用无菌涂布棒均匀涂布，放入30 ℃温箱培养7 d。肉眼观察生长出来的菌株，通过形态学观察菌落特征，挑取单个菌落接种在2216固体平板培养基中，30 ℃温箱培养2～3 d，可获得纯培养菌株。

1.3 菌株的镜检

将待检测菌株分别培养20、30和48 h(延滞期、对数生长期、稳定期)3个时间段，菌株在每个时间段均培养一个平板，菌株送至中国科学院微生物研究所公共仪器平台扫描电镜室观察其形态结构，细菌经过革兰氏染色后，在1 000×镜下观察。

分离到的3株细菌(SZDIS-1-1、GZDIS-1和SZDIS-2)电镜下观察可见，3株细菌呈短杆状、菌体紫色的革兰氏阳性细菌；菌体SZDIS-1-1呈短杆状，部分成簇排列，大小为(1.5～1.8)μm×(0.6～1.1)μm；GZDIS-1呈短杆状，大多数单一排列，大小为(1.5～1.8)μm×(0.6～1.0)μm；SZDIS-2呈短杆状，大多数单一排列，大小为(0.26～0.28)μm×(0.42～0.44)μm。

根据比对结果，选择与3株同源性较高菌株的16S rRNA序列，经过ClustalX软件对所得序列进行处理对齐，用MEGA5.0软件，采用邻接法构建系统发育树(neighbor-joining)。见图2。

1.4 DNA的提取与16S rRNA检测

分别在Pubmed、Int J SystEvolMicrobiol和知网等网站上进行文献检索，检索词为猪圈、猪、细菌、猪发酵床与分离细菌为题名、主题词和自由词检索。查找从猪圈使用初期发酵床中分离细菌的种类，将分离到的细菌与初期发酵床优势细菌的标准菌株进行生理生化特征的比对分析，得出此次分离菌株的不同特征及预防措施。

药敏纸片扩散(Kirby-Bauer)法进行药物敏感性试验，操作和结果判读标准参照美国临床实验室标准化委员会制定的标准。将分离鉴定的微杆菌属菌株分别在2216培养基上生长36 h，挑取菌落配制浓度为0.5麦氏浊度菌悬液(分光光度计值约为0.1 D)；将调好浊度的菌悬液尽快均匀涂布于2216平板培养基上，放置片刻，在培养基底部标记数字符号，以区分不同的抗生素；用无菌镊子贴相应的药敏纸片，保持纸片间距>40 mm。以金黄色葡萄球菌ATCC 25933作为质控菌株，30 ℃温箱培养48 h，观察培养板中抑菌圈生长情况并记录结果，每组细菌样本重复5次。

1.5 分离菌株与发酵床优势菌株系统发育树的构建

分离菌株测序所得序列与GenBank和EzTaxon-e数据库中进行比对[8]，选取相似性最近的已发表的典型菌株作为参比对象；发酵床优势菌株的16S rDNA基因序列从NCBI查找，在NCBI获得相应的序列，经过ClustalX软件对所得序列进行处理对齐[9]，用MEGA5.0软件，采用邻接法 (neighbor-joining)构建本研究分离菌株和发酵床优势菌株系统发育树，Bootstrap值为1 000次[10]。

1.6 猪圈发酵床优势细菌特性的比对分析

将分离菌株接种于2216(MA)培养基上，30 ℃培养36 h；收集培养物，Chelex提取法提取菌株DNA，-20 ℃冰箱冷藏备用。16S rRNA基因扩增和送测：反应体系25 μL，2(EasyTaq PCR SuperMix12 μL；正向引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)1.0 μL，反向引物(1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′)1.0 μL，DNA模板1.0 μL，无菌超纯水10 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min为1个循环，扩增35个循环后，72 ℃延伸10 min。PCR扩增完成后，1.5%琼脂糖凝胶中电泳，置于紫外凝胶成像仪中观察目的条带。将合格产物送至北京诺赛基因有限公司测序，菌株测序所得序列与GenBank和EzTaxon-e数据库中进行比对，比对结果按16S rDNA基因序列相似性>97%的菌株归为同一菌种[8]。

1.7 药物敏感性试验和生化特征的分析

在小学语文学习中，只依靠课堂时间是远远不够的，要想提高课堂的效率，还需要花费一些课后的时间，尤其是课前预习，课前预习对于小学语文学习是非常重要的。课前预习工作做得好，学生对于课堂知识接受得快，接受得多，进一步使课堂活动比较轻松，从而提高了课堂的效率。

在30 ℃温箱培养7 d后，R2A培养基上肉眼可见到不同颜色、形状的菌株长出。挑取不同形状的菌株，重新三区划线法转接新的无菌培养基平板，得到3株菌株，分别是SZDIS-1-1、GZDIS-1和SZDIS-2，见图1。

2 结果

2.1 细菌的生长情况

当Y>Y*时，dX1/dt>0,dX2/dt<0，则x2=1是演化稳定策略，政府激励无效的概率为1，此时购房者购买普通房，或者政府不奖励被动房的购房者，导致原来选择被动房的购房者转变为购买普通房，博弈收敛于帕累托劣均衡。

  

SZDIS-1-1 GZDIS-1-1 SZDIS-2图1 无菌培养基中3株菌落形态Fig.1 Three species of bacterial colony in aseptic medium

2.2 细菌的形态、大小和排列特点

利莫那班对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的抑制作用及其机制研究 …………………………………… 扈晓霞等（21）：2921

2.3 16SrRNA序列分析及系统发育树

第二、地名、物品和人名中的白银文化。在白银冶炼左近区域有许多与白银有关的地点、物品和人名。除上文提及的 “八宝掉坝”、“二金婆”等外，还有如白银驿道。白银驿道即从上洋村经麻岭村到泗桥的古驿道，长约10公里，宽1.0米至2米，阶高约10厘米，造工精细，是古时通往政和的必经之路，张彭八炼成的白银均由该驿道运出，故称白银驿道。芹溪明代被称为银溪。“官司”则是明代驻军保护银矿开采而名。曾荣获国际大奖的官司茶即因生长于斯，吸收了大量微量元素之故。

2.4 猪圈分离细菌的生理生化特性

  

图2 基于16S rRNA序列构建发酵床分离菌株的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of strainson16S rRNA sequence structure about sawdust bed inthepigpen

本研究将分离到的3株细菌与使用初期发酵床优势细菌的标准菌株进行生理生化特征的比对分析。查文献得知，猪圈发酵床使用初期优势菌种为短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)、乳微杆菌(Microbacteriumlacticum)、短状杆菌(Brachybacteriumzhongshanense)、琼式不同杆菌(Acinetobacterjunii)[11-16]。经比对，7株细菌有以下共同点：镜下均为杆状，过氧化氢酶、吲哚试验均为阴性，能够利用麦芽糖作为生长碳源，见表1。

 

表1 分离菌株与发酵床优势标准菌株的生理生化特征Tab.1 Different physiological-biochemical characteristics of the type strain of the sawdust bed in a pigpen

  

鉴定项目菌株SZDIS-1-1GZDIS-1SZDIS-2短芽孢杆菌乳微杆菌短状杆菌琼式不同杆菌菌落颜色淡黄色淡黄色黄色白色黄色乳白色乳白色鞭毛--+----细胞形态短杆状短杆状棒状直杆状短杆状短杆状球杆状最适生长温度(℃)30302845～553025～4537生长pH7.07.07.0～9.06.5～7.07.05.0～8.06.0～8.0最适生长NaCl006<5%15～100～3革兰氏染色+++可变性++-运动性+++++--需氧性兼性厌氧兼性厌氧好氧严格好氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧醌MK-10,MK-11MK-10,MK-11 MK-9,MK-10,MK-11MK-7NDNDNDDNA G+C mol(%)71.171.171.646.769.371.242.0淀粉水解++-----吲哚-------H2S产生++-++--硝酸盐还原---+-+-氧化酶---w---触酶+++w+++葡萄糖+++ND+--蔗糖--+ND+++麦芽糖+++++++果糖++++++-

注：“+”为阳性，“-”为阴性，“ND”为未检测，“w”为反应弱

2.5 药敏试验

3株细菌样本的抑菌圈直径比较，差异有统计学意义(P<0.05)；从抑菌圈直径变化可见，3株细菌对阿米卡星、头孢呋辛、利福平、妥布霉素、青霉素和环丙沙星等抗生素比较敏感，其中头孢呋辛抑菌最佳。见表2。

 

表2 菌株SZDIS-1-1、GZDIS-1和SZDIS-2抗生素药敏试验(n=5)Tab.2 Drug sensitive test of SZDIS-1-1, GZDIS-1 and SZDIS-2 strains against common antibiotics

  

抗生素种类抗生素符号纸片药物含量(μg/片)抑菌圈直径(x±s,mm)SZDIS-1-1GZDIS-1SZDIS-2红霉素(Erythromycin)E15---克拉霉(Clarithromycin)CLA15---利福平(Rifampin)RA530.31±0.8129.93±1.0628.24±1.23四环素(Tetracycline)TE30--20.01±0.85青霉素(Peniciuin)G.P 10 IU28.10±1.0127.87±1.2626.13±0.33氯霉素(Chloramphenicol)C30--25.36±0.78阿米卡星(Amikacin)AN3022.55±0.8523.01±0.2122.10±1.01头孢呋辛(Cefurosime Sodium)CXM3030.03±0.2331.02±0.2831.18±2.05妥布霉素(Tobramycin)TM1015.16±2.0516.05±0.7812.10±1.36环丙沙星(Ciprofloxacin)CIP520.47±1.0822.12±0.7520.14±1.20

注：“-”表示无抑菌圈

3 讨论

对猪圈发酵床进行细菌分离、培养研究，了解猪圈的生存环境，及时采取正确的抑菌措施，关系着猪的健康和猪肉质量，也关系着人类的健康[17-19]。

微杆菌属(Microbacterium)是以呼吸代谢为主的化能异养菌，属于微球菌科(Microbacteriaceae)、放线菌目(Actinomycetales)、放线菌纲(Actinobacteria)，在1919年被科学家Orla-Jensen发现[20]。本研究分离得到的细菌菌株SZDIS-1-1、GZDIS-1和SZDIS-2均属于微杆菌属细菌，是一类革兰氏阳性菌；菌株SZDIS-1-1、GZDIS-1生理特征为菌落颜色为淡黄色、最适生长温度和最适pH分别为30 ℃和7.0、无鞭毛但具有运动性、在有氧和无氧环境下均能生长，淀粉水解、H2S产生、触酶、葡萄糖、麦芽糖以及果糖等生化特征均为阳性，而吲哚试验、硝酸盐还原、氧化酶和蔗糖均为阴性。菌株SZDIS-2生理特征为菌落呈黄色、有鞭毛且具有运动性、最适生长温度和最适pH分别为28 ℃和7.0～9.0、在有氧环境下生长，生化特征为淀粉水解、H2S产生、触酶和葡萄糖发酵呈阳性，吲哚试验、硝酸盐还原和氧化酶为阴性。3株菌与发酵床优势菌株相比，菌株特性明显；SZDIS-1-1、GZDIS-1具有淀粉水解试验阳性、不利用蔗糖的独特生化特征，SZDIS-1-1，GZDIS-1最适NaCl为0%和SZDIS-2最适NaCl达到9%。

近来，微杆菌属细菌陆续被发现于乳制品、污水、血液、日常生活环境、医院病床以及临床样本中[21-24]。本研究分离得出的3株微杆菌属细菌，为首次在猪圈发酵床中分离，初步怀疑其可能具有致病性，还需要后续试验进一步观察。经药敏试验可知，SZDIS-1-1、GZDIS-1对利福平、青霉素、阿米卡星、头孢呋辛、妥布霉素以及环丙沙星敏感，对红霉素、青霉素、克拉霉素、四环素以及氯霉素耐药；而SZDIS-2对红霉素和克拉霉素敏感，对利福平、青霉素、阿米卡星、头孢呋辛、妥布霉素、环丙沙星、青霉素、四环素以及氯霉素耐药。将3株细菌对阿米卡星、头孢呋辛、利福平、妥布霉素、庆大霉素以及环丙沙星等常见抗生素比较敏感，而头孢呋辛抑菌效果更明显。此次研究结果增加了猪圈发酵床微生物的多样性、促进了微生物多样性的发展；对菌株进行抑菌试验分析，为日后临床分离到该菌株提供借鉴意义。

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