幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是一种具有潜在致残性及慢性非化脓性关节炎。按照国际联盟风湿病协会(ILAR)分类，根据发病初期6个月内受累关节数目、及是否存在关节外受累，将JIA分为7种亚型[1]，虽然统一以JIA命名，但各亚型却有不同的发病机制和临床表现[2]。近年来，越来越多观点认为全身型JIA属于自身炎症性疾病，不同于以自身免疫性疾病为主要表现的其它亚型[3-4]，本研究对JIA常见各亚型患儿血常规、C反应蛋白(CRP)、血沉(ESR)、降钙素原(PCT)指标，淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+及CD4+/CD8+比值，免疫球蛋白(Ig)G、IgM、IgA及补体C3、C4水平进行分析，探讨免疫功能检测在不同亚型JIA中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2012年1月～2016年12月住院治疗的初诊急性期JIA患儿164例，其中男98例，女66例；年龄1.1～14.5岁，平均(6.9±3.2)岁；病程0.4～46个月，平均(7±10)个月。入选JIA患儿均符合2001年ILAR修订的诊断标准[1]，未使用激素和生物制剂者。临床分型为全身型68例，少关节型32例，多关节型34例，附着点型30例。使用幼年关节炎活动评分-27(juvenile arthritis disease activity score-27，JADAS-27)标准计算疾病活动评分[5]，并收集临床资料。对照组为同期健康体检儿童50例，男30例，女20例；年龄1.7～15.4岁，平均(6.5±2.9)岁。两组儿童年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究得到医院医学伦理委员会批准，取得家长知情同意。

1.2 主要仪器与试剂

CD3-藻红蛋白(PE)、CD4-人活化蛋白C(APC)、CD8-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD16CD56-PE、CD19-FITC、免疫荧光抗体、免洗溶血素和绝对计数管(TruCount tube) 均购自美国 BD Biosciences公司。血清免疫球蛋白检测仪为美国Beckman Coulter IMMAGE免疫分析系统。FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 实验室常规指标、免疫球蛋白及补体检测

收集EDTA抗凝外周静脉血，1 000 r/min离心10 min后，提取血清，采用散射比浊法对血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及补体C3、C4进行检测。采集研究对象静脉血1mL，加入EDTA-3K抗凝管内，按比例稀释后充分混匀，Sysmex KX-21型全自动计数仪检测血常规。抗环瓜氨酸多肽(CCP)抗体检测采用ELISA方法，抗核抗体(ANA)检测采用免疫印迹法，类风湿因子(RF)检测采用乳胶增浊透射比浊法，仪器为日立7180全自动生化分析仪。

1.4 淋巴细胞亚群检测

取抗凝血100 μL，加入相应荧光抗体20 μL振荡器混匀，室温避光15 min后，加入450 μL 1×FACS溶血素，室温静置15 min，振荡器混匀后上机检测。流式细胞术(FCM)以侧向角散射(SSC)为横坐标，前向角散射(FSC)为纵坐标，构建散点图分析T淋巴细胞亚群百分比。采用Flowjo(V5.7.2)软件分析结果。

各亚型JIA患儿的CD3+、CD4+均高于对照组(P<0.05)，全身型组JIA患儿的CD3+水平高于少关节组(P<0.05)，CD8+水平均高于少关节组、多关节组和附着点型组(P<0.05)，NK水平均低于对照组和少关节组(P<0.05)，多关节组CD8+水平低于对照组(P<0.05)，CD4+/CD8+比值明显高于对照组、少关节组和附着点型组(P<0.05)。见表3。

多关节组JIA患儿CD8+细胞水平与JADAS-27评分呈负相关(r=-0.36，P<0.05)，附着点组JIA患儿CD4+细胞水平与JADAS-27评分呈正相关(r=0.42，P<0.05)，其余亚型组JIA患儿淋巴细胞亚群与JADAS-27评分不相关(P>0.05)。见图1。

1.5 统计学方法

本研究发现CD4+ T细胞在各个JIA亚型中都存在明显活化，各亚型JIA外周血中CD4+ T细胞均明显高于对照组，而附着点型CD4+T细胞比例与疾病活动评分呈正相关。推测其机制可能是：CD4+ T细胞不仅可以通过介导B细胞来分泌自身抗体，而且可以触发多种炎性介质释放，参与关节滑膜成纤维细胞、内皮细胞及血管翳的形成，这可能是JIA患儿体内高滴度自身抗体及关节局部组织增厚的重要原因[11]。其他学者的研究也发现在胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)动物模型中，CD4+ T细胞对关节软骨具有破坏作用[12]。提示除了传统观点认为的杀伤性T细胞CD8+T细胞对关节的直接破坏和损伤外，也需要重视辅助性T细胞CD4+T细胞通过分泌细胞因子，诱导免疫活化等间接作用在JIA发病中的作用。因此，对JIA患儿(尤其是附着点型)外周血中CD4+ T细胞进行检测，可能是反映患儿疾病活动程度的间接指标。

2 结果

2.1 血常规异常情况，CRP、ESR和PCT水平，JADAS-27评分以及RF、抗CCP和ANA阳性率

全身型JIA患儿中，有76.47% WBC升高，以中性粒细胞升高为主；83.82%存在贫血, 73.53%有PLT升高； CRP、ESR及PCT水平均明显高于其他亚型组(P<0.05)。多关节型组和附着点型组JIA患儿CRP及ESR水平均高于少关节型组JIA患儿(P<0.05)，32.35%多关节组型JIA患儿RF呈阳性，14.71%抗CCP抗体阳性，多关节型和少关节型组JIA患儿ANA阳性率高，多关节型组、附着点型组JIA患儿JADAS-27评分高于其他两型(P<0.05)。见表1、表2。

 

表1 JIA各亚型Hb、WBC、PLT异常及自身抗体阳性率(n,%)Tab.1 Hb、WBC、PLT abnormity and positive rate of autoantibody of JIA subtype groups

  

组别 nHb(g/L)～90 >90 WBC(109/L)总数>10.0 N升高为主PLT(109/L)>300RF阳性率抗CCP阳性率 ANA阳性率全身型组 6817(25.00)40(58.82) 52(76.47)55(80.88)50(73.53) 2(2.94) 1(1.47) 6(8.82)少关节型组32 2(6.25)11(34.40) 3(9.38) 5(15.63)14(43.75) 0(0.00) 1(3.13)11(34.30)多关节型组34 6(17.65) 9(26.50) 9(26.47)12(35.29)22(64.71)11(32.35) 5(14.71)10(29.50)附着点型组30 2(6.67)12(40.00) 6(20.00) 8(26.67)23(76.67) 1(3.33) 0(0.00) 0(0.00)

注：N表示中性粒细胞百分比

 

表2 JIA各亚型CRP、ESR、PCT水平及JADAS-27评分Tab.2 CRP, ESR, PCT levels and JADAS-27 scores of JIA subtype groups

  

组别n CRP(mg/L) ESR(mm/h) PCT(μg / L) JADAS-27(分)全身型组68 60.09±38.67(1)(2)(3) 83.44±30.85(1)(2)(3) 0.92±1.54(1)(2)(3)16.98±5.65少关节型组32 9.54±6.86 19.31±11.05 0.10±0.1514.96±5.41多关节型组34 35.54±30.21(1) 51.97±31.93(1) 0.17±0.13 20.48±4.93(1)附着点型组30 26.42±28.84(1) 69.62±40.74(1) 0.12±0.16 20.94±5.75(1)F 21.420 33.140 3.876 7.308 P 0.000 0.000 0.011 0.000

(1)与少关节型组比较，P<0.05；(2)与多关节型组比较，P<0.05；(3)与附着点型组比较，P<0.05

2.2 不同亚型JIA淋巴细胞亚群百分比

取出烧瓶，瓶口向着光源，背衬以黑色背景，平视观察水面下4 cm范围内浮游生物，每瓶每次观察时间不少于3 min。必要时可用放大镜观察。发现毛蚴后，用毛细吸管吸出，均匀分滴于载玻片上，观察其游动状态，然后加1滴碘酒固定，在显微镜下（放大倍数为40～100倍）观察形态。毛蚴应与水中原生动物相鉴别。为提高检出率，如孵化阴性，可进行沉渣镜检虫卵。

 

表3 JIA各亚型组与对照组淋巴细胞亚群百分比Tab.3 Percentage of lymphocyte subsets in JIA subtype groups and controls

  

组别 nCD3+CD4+ CD8+ CD16+CD56+ CD19+CD4+/CD8+全身型组 68 74.28±8.65(1)(2)37.23±6.57(1)33.06±7.95(1)(2)(3)(4) 12.11±6.25(1)(2) 12.91±7.501.40±0.90 少关节型组3268.99±5.85(1)36.40±4.59(1)27.98±4.0615.13±6.0414.13±4.291.30±0.38多关节型组3469.36±8.86(1)39.88±5.96(1)24.46±5.61(1)13.96±7.4814.60±7.161.70±0.84(1)(2)(4)附着点型组3070.79±5.42(1)36.49±3.31(1)26.96±3.9914.43±4.3213.09±4.251.28±0.25对照组 5060.71±5.3032.29±5.6028.23±7.5616.29±3.1415.06±3.271.23±0.39F25.9009.71111.930 4.225 1.2672.865P0.0000.0000.0000.0030.2850.024

注：CD16+CD56+指NK细胞，(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与少关节型组比较，P<0.05；(3)与多关节型组比较，P<0.05；(4)与附着点型组比较，P<0.05

2.3 JIA不同亚型Ig及补体水平

由此可见，在富弼心目中，吕夷简一直是“为恶者”，是“小人”“恶人”“奸人”，一定要在《墓志铭》里明确“褒善贬恶”，而邵氏的评价，也认为欧阳修没有据实书写，这充分代表了后世所谓君子党的看法。由于上述种种因素，历史上不乏批评吕夷简者，甚至目其为奸相，但李焘《长编》对他的评价比较公允：

 

表4 JIA各亚型组与对照组Ig及补体水平Tab.4 Comparison of Ig and complement in JIA subtype groups and the control group

  

组别nIgG IgM IgA C3 C4 全身型组 6813.67±5.28(1)(2) 1.75±0.67(1)(2) 2.23±1.31(1)(2) 1.48±0.29(1)(2) 0.30±0.11(2)(3)少关节型组32 9.98±1.54(1) 1.35±0.49 1.27±0.51 1.17±0.290.24±0.04多关节型组3413.36±4.10(1)(2) 2.05±0.83(1)(2) 2.40±0.85(1)(2) 1.49±0.39(1)(2)0.24±0.05附着点型组3014.97±5.26(1)(2) 1.78±0.59(1)(2) 3.35±1.51(1)(2) 1.60±0.29(1)(2) 0.31±0.10(2)(3)对照组 507.26±1.12 1.18±0.37 0.93±0.34 0.98±0.250.26±0.07 F26.73013.11032.33028.8806.008 P0.0000.0000.0000.0000.000

(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与少关节型组比较，P<0.05；(3)与多关节型组比较，P<0.05

2.4 不同亚型JIA淋巴细胞CD8+、CD4+亚群与JADAS-27评分相关性分析

市中心远远地朦朦胧胧地站着，行人很少，全街静悄无声。我们一家挨一家地问着，我比她更急切，我想赶快买到吧，我小心地盘问着那些店员们，我从来不放弃一个细微的机会，我鼓励翠姨，没有忘记一家。使她都有点儿诧异，我为什么忽然这样热心起来，但是我完全不管她的猜疑，我不顾一切地想在这小城里，找出一双绒绳鞋来。

  

图1 JADAS-27与不同亚型JIA组淋巴细胞亚群CD8+和CD4+相关性Fig.1 Correlation between JADAS-27 and lymphocyte subsets in JIA subtype groups

3 讨论

JIA是由感染、环境等因素诱发的具有遗传背景个体致病的一组异质性疾病[6-7]。关于JIA的发病机制，过去认为适应性免疫参与的免疫调节异常可能是关键，因此统一将JIA归为自身免疫性疾病范畴[8]。近年来，有观点认为全身型JIA主要是固有免疫系统介导的自身炎症性疾病，应独立于JIA命名之外[9-10]，但仍有争议。本文研究不同JIA亚型的免疫学功能特点，包括体液免疫活化的免疫球蛋白和补体的表达，以及特异性免疫细胞T、B淋巴细胞和非特异性免疫细胞NK细胞表达水平，并且分析这些免疫学特征与临床表现的关系，为探讨不同亚型JIA的发病机制提供思路。

各亚型JIA患儿IgG水平均高于对照组(P<0.05)，全身型组JIA患儿IgG、IgM、lgA水平均高于少关节组(P<0.05)，C3、C4水平均高于少关节和多关节组(P<0.05)；多关节组IgG、IgM、IgA水平均高于少关节组(P<0.05)；附着点型组JIA患儿IgG、IgM、IgA水平均高于少关节组(P<0.05)，C3、C4水平分别高于少关节组和多关节组(P<0.05)，见表4。

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，有统计学差异时进一步行SNK检验，相关性分析采用Pearson直线相关。检验水准α=0.05。

本研究还发现全身型JIA患儿相对于其他亚型JIA患儿非特异性免疫细胞NK细胞比例显著下降。NK细胞的表面标志为CD16+CD56+，通过脱颗粒作用对已活化的T细胞具有杀伤活性，在自身免疫性疾病中发挥负性调节作用[13]。全身型JIA中NK细胞比例明显降低，其对T细胞抑制作用明显减弱，致使T淋巴细胞和巨噬细胞过度活化后释放大量炎性因子，导致“细胞因子风暴”[14]，这说明天然免疫失调在全身型JIA发病中的作用，这不同于JIA其他亚型的免疫学特点，也可能是全身型JIA相对于其他亚型JIA更易并发巨噬细胞活化综合征(macrophage activation syndrome, MAS)的原因。

“其实我之前就能感觉到颅骨的主人是你的父亲，在你收藏的207块骨骼中，它是多么与众不同。”她歪着头说道。

体液免疫B淋巴细胞的多克隆活化也在JIA的炎症损伤中发挥重要作用[15]。本研究发现各个亚型的JIA患儿免疫球蛋白IgG、IgA、IgM都全面升高，各个亚型间分析表明：少关节型IgG、IgA、IgM升高不如其他亚型明显，而附着点型患儿IgG、IgA、IgM升高最为明显。这也可以解释少关节型患儿对于其他亚型JIA临床症状更轻，远期预后更好，而附着点型即使受累关节不是最多，但是致残率却最高的原因。

综上所述，JIA发病机制复杂，非特异性免疫应答和特异性细胞免疫和体液免疫均参与其发病，而不同亚型JIA患儿有不同的免疫学特征，表现为全身型CD8+ T细胞水平更高，NK细胞水平更低，多关节型CD4+/CD8+比值更高，附着点型有更高的免疫球蛋白和补体。因此，对不同亚型JIA进行免疫功能监测，有助于患儿疾病活动程度的判断和预估。

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