前期动物实验证实，尼古丁与血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)联合调控基质金属蛋白酶(metrix metalloproteinases, MMPs)表达诱导腹主动脉瘤形成[1]，然而具体机制尚待深入研究。炎症是腹主动脉瘤形成和破裂的主要原因，参与其中的炎症细胞包括巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和T、B淋巴细胞等[2]。肥大细胞脱颗粒可以释放多种活性物质，包括类胰蛋白酶、组织蛋白酶、胃促胰酶和组织蛋白酶等，这些酶可激活MMPs，还可直接降解细胞外基质，导致血管中层平滑肌细胞凋亡；肥大细胞释放的炎症因子如组胺、肿瘤坏死因子α等也可以诱导巨噬细胞等炎症细胞的浸润，并激活肾素-血管紧张素系统[3]，因此肥大细胞脱颗粒的多效反应可能在主动脉瘤形成中发挥作用[4]。 弹力蛋白是动脉血管中膜弹性功能和重要的结构屏障，在维持血管壁弹性和血管壁完整性中发挥重要作用[5]，血管壁局部弹力纤维破坏，导致局部弹力纤维薄弱或断裂，血液通过薄弱或断裂的主动脉中膜渗出至外膜下形成血肿，从而形成腹主动脉瘤。本研究观察尼古丁联合血管紧张素Ⅱ诱导腹主动脉瘤模型小鼠血管中膜弹力蛋白及肥大细胞的变化。

1 实验方法

1.1 动物、主要药品与设备

10～12个月龄雄性C57BL/6J小鼠购自北京维通利华公司，标准 SPF级饲养；尼古丁和AngⅡ购自美国Sigma-Aldrich公司；胶囊渗透压泵(Alzet,Model 2004)购自美国DURECT公司；类胰蛋白酶ELISA试剂盒(CSB-E14326m)购自武汉华美生物科技有限公司。

1.2 动物模型建立及标本采集

40只小鼠被分为对照组、尼古丁组、AngⅡ组和尼古丁联合AngⅡ组，每组 10只，分别皮下灌注生理盐水、尼古丁、AngⅡ、尼古丁联合AngⅡ。尼古丁4 mg/(kg·d)，AngⅡ 0.72 mg/(kg·d)，通过埋置到小鼠的背部肩胛区皮下的胶囊渗透压泵持续灌注 28 d后处死小鼠，抽取动脉血，并取主动脉组织。

1.3 腹主动脉组织切片制备

腹主动脉(纵膈裂孔至肾动脉段)组织经脱水、透明、石蜡包埋、切片(3 μm)，平整固定于载玻片上，45 ℃角斜置烤片30 min、于60～62 ℃烤箱中烘烤30～60 min Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色；同时每间隔15 μm取切片1张，每只小鼠取3张切片行甲苯胺蓝法观察肥大细胞。

1.4 观察指标

1.4.1 弹力蛋白及肥大细胞 VVG染色后，光学显微镜观察腹主动脉中膜弹力蛋白，弹力蛋白染成蓝黑或黑色，核染成蓝色或黑色；用甲苯胺蓝染色后，光学显微镜观察肥大细胞及脱颗粒情况，紫红色细胞为肥大细胞，其周围细小的紫红色颗粒为肥大细胞释放的胞浆颗粒。

对照组小鼠腹主动脉中偶见肥大细胞浸润外膜，但未见有明显脱颗粒现象；其余3个实验组小鼠均可见腹主动脉外膜有肥大细胞浸润，在肥大细胞周围可见细小紫红色颗粒；4组小鼠的腹主动脉中膜及内膜均未见肥大细胞浸润，尼古丁联合AngⅡ组为腹主动脉瘤，可见中膜断裂及外膜下血肿见图2。肥大细胞计数显示，与对照组小鼠比较，其余3组小鼠腹主动脉浸润的肥大细胞明显增多(P<0.01)，见图3。

尼古丁联合AngⅡ组小鼠腹主动脉有动脉瘤形成，发生率为50%(5/10)，而对照组、尼古丁组和AngⅡ组小鼠未见腹主动脉瘤形成。弹力蛋白染色结果显示，尼古丁组、AngⅡ组和尼古丁联合AngⅡ组小鼠的弹力蛋白有不同程度的破坏，表现为弹力纤维变直、稀疏，尼古丁联合AngⅡ组可见弹力纤维断裂和外膜下血肿，断裂点和外膜下血肿连通。见图1。

1.5 统计学分析

采用GraphPad Instat software (GraphPad Software,Inc.,San Diego CA)对数据进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，运用方差分析并采用 Bonferroni事后检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹主动脉观察及动脉弹力蛋白改变

本刊讯 12月18日上午，庆祝改革开放40周年大会在北京人民大会堂举行。省人大常委会副主任王随莲、王良、齐涛、王云鹏，机关党组成员，机关及事业单位党员干部职工200余人集体收看大会实况，仔细聆听习近平总书记的重要讲话。

  

注：A1～A4为各组腹主动脉，A4可见腹主动脉瘤形成；B1～B4和C1～C5为各组小鼠主动脉的VVG染色；B1～B4为完整腹主动脉横断面，B4可见明显腹主动脉瘤形成(100×)； C1可见弹力纤维呈波浪型平行密集排列，C2、C3和C4可见弹力蛋白变直、稀疏、部分弹力纤维不连续，C5可见弹力纤维断裂、断裂点与外膜下血肿连通(400×)图1 各组小鼠腹主动脉大体观及VVG染色镜下表现Fig.1 Macroscopical anatomy of abdominal aortas and elastic fibers within them in various group

  

图2 各组小鼠腹主动脉各层组织中肥大细胞浸润情况Fig.2 Infiltration of mast cells in different layer of abdominal aorta in various group

2.2 腹主动脉各层组织中肥大细胞浸润情况

1.4.2 血清类胰蛋白酶 小鼠皮下灌注28 d，麻醉后于左心室穿刺取动脉血，血液凝固后，4 ℃ 1 000 g离心15 min收集血清，ELISA试剂盒检测血清类胰蛋白酶浓度，酶标仪于波长450 nm测定吸光度值。

  

(1)与对照组比较，P<0.01图3 腹主动脉外膜中肥大细胞计数Fig.3 Number of mast cells recruited into adventitia of abdominal aorta

2.3 血清类胰蛋白酶

肥大细胞是炎症细胞的组成细胞之一，其通过脱颗粒反应在体内发挥病理生理作用。肥大细胞脱颗粒可以释放炎症因子、类胰蛋白酶和基质金属蛋白酶，也可以激活肾素-AngⅡ-醛固酮系统。血浆中类胰蛋白酶主要由肥大细胞脱颗粒释放，是检测体内肥大细胞脱颗粒反应的重要指标。动物实验研究发现，肥大细胞类胰蛋白酶缺陷可减轻小鼠腹主动脉瘤的形成，是目前肥大细胞脱颗粒参与主动脉瘤形成的直接证据[7]。

  

(1)与对照组比较，P<0.01图4 各组小鼠血清类胰蛋白酶水平(ELISA法)Fig.4 Tryptase level in plasma of mice in various group

3 讨论

改造小流域的雨水管网体系，与雨洪控制利用措施体系和河网体系相辅相成，控制建设地块雨水外排，并保证超标准雨水外排通畅。新建项目排水体制采用雨污分流制。已建项目采用因地制宜的排水体制，对无排水系统街巷或院落新建分流制排水系统，对有排水系统的进行系统改造。

与对照组比较，尼古丁、AngⅡ和尼古丁联合AngⅡ 3组小鼠血清中类胰蛋白酶浓度明显增加(P<0.01)，见图4。

炎症和金属蛋白酶释放等是腹动脉瘤形成的重要机制，在腹主动脉瘤形成中发挥着重要作用[6]。金属蛋白酶降解细胞外基质包括胶原和弹力蛋白，是腹主动脉瘤形成的重要机制。本研究观察到尼古丁和AngⅡ单独或联合作用，均可导致不同程度的弹力蛋白的破坏，在尼古丁或AngⅡ单独灌注组，弹力蛋白表现为稀疏、变直、部分弹力纤维不连续，而二者联合诱导了腹主动脉瘤的形成，在瘤形成的部位可见有弹力纤维断裂并有血液通过，断裂的弹力蛋白从中膜渗出至外膜下形成假性动脉瘤，提示弹力蛋白降解在尼古丁联合AngⅡ诱导的主动脉瘤形成中发挥着重要作用，但是哪种蛋白酶降解弹力蛋白尚不明确。

动物实验表明，AngⅡ可诱导腹主动脉瘤形成，也有 AngⅡ诱导大鼠血管壁内肥大细胞脱颗粒导致血管通透性增加的报道，但AngⅡ诱导的肥大细胞脱颗粒是否参与腹主动脉瘤形成仍缺乏直接证据[8]。本实验证实，AngⅡ导致腹主动脉组织内肥大细胞浸润外膜并脱颗粒且血清中类胰蛋白酶浓度明显增高， 提示在本实验的动物模型中，AngⅡ诱导了肥大细胞进入腹主动脉壁并脱颗粒可能在AngⅡ诱导的腹主动脉瘤中发挥重要作用。近期研究发现，尼古丁也具有诱导腹主动脉瘤形成的作用，其具体机制尚待探讨[9]。体外实验发现，尼古丁能够诱导人类肥大细胞瘤细胞(HMC-1)脱颗粒[10]。本研究结果显示，类似于AngⅡ，尼古丁也具有诱导腹主动脉组织内肥大细胞浸润外膜并脱颗粒的作用，且二者联合诱导的肥大细胞浸润和脱颗粒更加明显，提示二者联合可增强肥大细胞脱颗粒反应并诱导腹主动脉瘤形成。

在聚烯烃材料中，抗氧剂用量最广泛的是1010，分子式如图1所示。它能有效地防止聚合物材料在长期老化过程中的热氧化降解，并且由于每个分子上有4个受阻酚官能团，因此具有高效的抗氧化能力。

想要达到理想的ISO14001绩效，需要企业有较强的学习能力、知识整合及较强的落实能力。通过认证机构的审核，能有效降低受审核企业知识获取成本，发现企业自身在长期的经营管理活动中忽视的问题，结合财务管理系统，优化业务流程。结合企业财务管理及内部控制现状，在某种程度上，可以说认证机构审核延长了企业财务管理的触角，对企业的内部控制起到了很好的补充作用。

腹主动脉瘤形成主要是由于中膜弹力蛋白和胶原降解，本研究中也观察到中膜断裂，然而并未观察到肥大细胞浸润腹主动脉中膜和内膜，在中膜断裂位点也未见肥大细胞浸润和颗粒浸润，因此未显示肥大细胞浸润和脱颗粒与破裂位点存在直接关系，这可能与标本留取的时间有关，亦可能提示肥大细胞脱颗粒通过间接机制诱导主动脉瘤的形成。在药物灌注诱导主动脉瘤形成模型中，腹主动脉瘤形成主要发生在灌注后的1～2周，也就是说，灌注后的1～2周可能是炎症反应最强烈的时间，是否在此时间点有更强的肥大细胞反应有待实验证实。

总之，尼古丁和AngⅡ可能是肥大细胞脱颗粒的诱导剂，二者联合可通过降解弹力蛋白诱导腹主动脉瘤形成，肥大细胞脱颗粒可能在其中发挥重要作用。尼古丁和AngⅡ单独或联合诱导肥大细胞脱颗粒及其诱导腹主动脉瘤形成的机制尚待深入探讨。

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