结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球致死率第二位的肿瘤[1]，统计数据表明，CRC逐渐成为威胁人类健康的主要恶性肿瘤，男性患病率约为25.83/105、占据男性肿瘤的第五位，女性患病率约为20.08/105、占据女性肿瘤的第三位，CRC的死亡率男女均列第五位[2-3]。目前手术切除仍然作为结肠癌的主要治疗方法[4]。尽管癌症筛查受到重视，手术联合放化疗也取得了进展，但是CRC病人的整体生存率没有得到显著提高[5] 。因此，深入探讨CRC细胞死亡的调控机制，为药物治疗提供靶点，成为肿瘤治疗的重要研究方向。雷公藤甲素(triptolide，Tp)是从中药雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f．)中提取的一种具有松香烷结构的三环氧二萜内酯类化合物[6-7]，其单体可以抑制细胞因子释放，广泛用于炎症和自身免疫反应的控制[8]，有研究报道Tp具有抗肿瘤效应[9-11]。本课题组前期研究已证实Tp对大肠癌增殖的抑制作用和周期阻滞作用[12-13]，本研究就Tp对大肠癌细胞表型的影响以及信号通路激活的情况进行初步探讨。

教学评价贯穿于教学活动的各个环节，起到诊断教学活动的“症结”、评价教学活动的效果、调控教学活动方向的作用，是教学活动实施的重要保障。本文从教学评价的内涵、教学评价的构建理论、传统教学评价的局限性和初中英语多元评价体系的构建四个方面阐述新课标下初中英语教学多元评价的探究。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

人结肠癌SW480、SW620和HCT116细胞由本实验室保存。Tp购自南京泽朗医药技术有限公司，纯度超过98%，溶于二甲基亚砜(DMS0)配制成5 mmoL/L保存液，使用时稀释。RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品，胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)购于美国Hyclone公司，DMS0和胎牛血清干粉为广州佳研生物技术有限公司产品，蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂均购自于南京碧云天生物技术公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于索莱宝生物科技有限公司。GAPDH、p53兔一抗和HRP标记的抗鼠/抗兔二抗和Path Scan Intracellular Signaling Array Kit均购自于Cell Signaling Technology公司，ECL化学发光液购于美国Millipore 公司，荧光倒置显微镜为日本Olympus公司产品，YZ-1450型层流超净工作台购于苏州净化设备公司，二氧化碳恒温孵箱、全自动酶标仪购自美国Thermo公司，电泳仪和转膜仪购自美国Bio-Rad公司、Kodak Image Station 2000MM成像系统购自美国Kodak公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物刺激 将SW480，SW620和HCT116细胞铺于10 cm细胞培养皿中，常规用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养，24 h后用40 nmol/L的Tp刺激，含相同浓度的DMSO培养基作为对照，分别于刺激0、24 h时对细胞进行拍照，观察细胞形态。

1.2.2 Path Scan检测 取对数生长期的SW480细胞铺于10 cm细胞培养皿中，给予40 nmol/L的Tp刺激24 h，一部分细胞用于收集蛋白进行Western blot 分析，另一部分细胞按照Path Scan Intracellular Signaling Array Kit试剂盒说明书进行蛋白提取、孵育；于Kodak Image Station 2000MM成像系统进行显影，分别检测细胞内信号通路分子ERK1/2的Thr202/Tyr204位点、Akt的 Thr308和Ser473位点，AMPKα的Thr172位点及p53的Ser15位点的磷酸化水平。

Path Scan结果如图2所示，与对照组相比较，Tp刺激后ERK1/2的Thr202/Tyr204位点磷酸化水平升高，Akt的Thr308和Ser473位点磷酸化水平增高，AMPKα的Thr172磷酸化水平降低，p53的Ser15位点磷酸化水平增高。其中，p53上调最为显著。

1.3 统计学分析

Western Blot验证结果显示(如图3)， 与对照组相比，40 nmol/LTp刺激后24 h 时SW480、SW620和HCT116细胞中p53蛋白磷酸化水平升高，与Path Scan实验结果一致。

2 结果

2.1 Tp引起人结肠癌细胞形态学改变

用40 nmol/L Tp刺激SW480人结肠癌细胞24 h，倒置显微镜下观察拍照。结果显示，在Tp的刺激作用下，SW480人结肠癌细胞变大，形态不规整，触角变长，细胞间隙变宽，见图1。

2.2 Tp调控人结肠癌细胞信号通路筛选

1.2.3 Western blot验证 SW480，SW620和HCT116细胞用40 nmol/L Tp刺激24 h后，收集的总蛋白用BCA法测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，取各组等质量的总蛋白进行电泳、待溴酚蓝跑出后进行转膜，脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜、二抗于摇床上室温孵育1 h后显影。将所得结果分别进行分析，实验重复3次。

  

图1 Tp刺激和24 h SW480细胞形态(100×)Fig.1 The morphological changes of SW480 cells stimulated by Tp for 24 h

  

图2 Tp刺激对SW480细胞相关信号分子磷酸化水平的影响(40 nmol/L Tp，24 h)Fig.2 Expression of proteins in SW480 under the treatment with 40 nmol/L Tp

2.3 Tp刺激人结肠癌细胞p53蛋白磷酸化水平

所得数据均用均数±标准差表示，用SPSS 22.0软件进行统计分析，两组比较在方差齐的时采用两独立样本t检验，方差不齐的时用Levene’s test，P <0.05为差异有统计学意义；统计后处理采用 GraphPad 5.0软件和Image J软件。

课题组前期已经证实雷公藤甲素能显著抑制结直肠癌细胞增殖和周期阻滞[14]。除此之外，本研究观察到Tp还可以引起SW480细胞发生表型的变化，通过浓度和时间的系列测试，发现在Tp的浓度为40 nmol/L、刺激时间24 h时，SW480形态改变最为明显。未受到刺激的SW480细胞，多数以三角形和菱形的形式存在，而被Tp刺激之后，细胞伸出触角，表现间质细胞的梭形形态。细胞形态的改变，往往是由细胞信号转导通路的激活，进而调控基因表达和蛋白的功能状态。因此，本研究用Path Scan对细胞信号通路进行筛查，发现 40 nmol/L TP刺激SW480细胞24 h后，细胞中ERK1/2的Thr202/Tyr204位点磷酸化水平升高，Akt的 Thr308和Ser473位点磷酸化水平增高，AMPKα的Thr172磷酸化水平降低，p53的Ser15位点磷酸化水平增高，其中p53上调最为显著。

这些位点的磷酸化或去磷酸化，是相关细胞信号通路被激活的标志[15-18]。人类ERK1和ERK2在序列上84%相同，并且共享许多功能。为此，他们被称为ERK1/2。与几乎所有的蛋白激酶一样，ERK1/2含有独特的N端和C端延伸，提供信号特异性。ERK1/2是亲水性非受体蛋白，参与Ras-Raf-MEK-ERK信号转导级联。其有时表示为促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联。该级联参与调节多种过程，包括细胞黏附，细胞周期进程，细胞迁移，细胞存活，分化，代谢，增殖和转录[15]。Citi V等[19]发现，对依维莫司耐药的T47D乳腺癌细胞系中，ERK1/2(Thr202/Tyr204)和Akt(Ser473/Thr308)的磷酸化增加。细胞水平的p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)和p-AKT(Ser473/Thr308)可以作为预测乳腺癌细胞对依维莫司反应的指标。

  

注：A为Western blot条带，B为Western blot结果柱状图；与对照组比较，(1)P<0.01，(2)P<0.05图3 Tp刺激对人结肠癌SW480、SW620和HCT116细胞p53蛋白磷酸化的影响(40 nmol/L Tp，24 h)Fig.3 Expression of p-p53 in SW480, SW620 and HCT116 under the stimulation of 40 nmol/L Tp

3 讨论

2.5.4 护士站。主要是一台PC机，它可以接收网关通过Wi-Fi发来的数据包，记录并监控每个病人的输液状态。护士站实时将数据传输至本地医疗数据中心，中心将数据录入个人医疗记录中。

三组比较，年龄、性别、受教育年限、糖尿病病程、BMI、空腹血糖、C肽、血脂差异均无统计学意义（P＞0.05）。与Non-DPN组相比，Painful DPN组有更低的HbA1C（P＜0.05）。三组患者MoCA评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。与Non-DPN组相比，Painful DPN及Painless DPN组SDS、SAS、SRSS得分均显著增高（P＜0.05，表1）。

Akt也被称为蛋白激酶B(PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其属于AGC蛋白激酶超家族，并且与其他AGC激酶一样受上游第二信使以及其他酶的调节。Akt由多位点磷酸化激活。 Akt激活涉及两个残基的磷酸化：活化环中的苏氨酸(Thr308)和C-末端疏水基序中的丝氨酸473(Ser473)[20]。在过去的研究中，许多临床研究已经证实了乳腺癌中磷酸化Akt激活及其在疾病进展和结局中的作用。AKT在乳腺癌转移中充当“主控制器”的角色，当Akt (Thr308/ Ser473)磷酸化被激活时，至少可以激活下游十种主要的调节蛋白。Akt作为信号转导关键点与上游细胞外因子包括胰岛素、IGF-1和EGF和下游如NF-KB,mTOR,GSK-3b和MDM-2共同形成细胞内信号调控网络，介导Akt对细胞生长、凋亡、迁移等的影响[21]。Akt表达异常不仅在乳腺癌中，在其它多种癌症中也失调。Akt(Thr308/Ser473)的磷酸化可作为非小细胞肺癌疾病预测和预后的标志[22]；结直肠癌中，通过降低Akt (Thr308/Ser473)磷酸化来上调转铁蛋白(TAGLN)，下调MMP-9表达，从而阻止细胞增殖和迁移[23]。由此，Akt Thr308和 Ser473位点磷酸化水平可作为癌症预测以及患者预后的一个重要的指标，对于癌症靶向药物的开发具有潜在的意义。

腺苷一磷酸 (AMP) 激活的蛋白激酶 (AMPK)的Thr172位点被上游激酶磷酸化所激活，是一种能量利用的调节蛋白，在调节正常细胞代谢中起着重要作用。但它现在被认为是癌细胞信号级联反应中关键蛋白分子。例如，在各种癌细胞中，激活AMPKα(Thr172)可诱导p53活化[24-25]和哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)复合物1(mTORC1)抑制[26]，以及自噬诱导[27]和致癌蛋白降解[28]。Alejandro等[29]还发现，AMPKα(Thr172)磷酸化与癌细胞周期进程相关，有丝分裂的癌细胞中磷酸化水平增加。

此外，本研究采用western blot进一步验证了在Tp刺激的结直肠癌SW480，SW620和HCT116细胞中p53磷酸化水平上调。过去三十年的研究已经将p53确定为多功能转录因子，在不同的细胞环境下，对细胞产生的影响也具有多样性和复杂性。但是，作为一个细胞周期DNA损伤修复的监测点[30]，p53受到各种压力而激活，通过启用DNA修复或通过推进细胞死亡程序来阻止癌症进展[31]。然而，大部分人类癌症中p53发生了突变，使其能够促进侵袭，转移，增殖和细胞存活[32-33]。已经有文章证明Tp通过p53依赖途径抑制人喉癌细胞，前列腺癌细胞等增殖[34-35]。Tp通过p53抑制IκBα的磷酸化和降解来阻断癌细胞中的NF-κB通路[36]。

摘 要：初中生的英语核心素养包括：语言能力、文化意识、思维品质、学习能力，共四个维度。初中英语课堂设计提倡发展学生思维品质，采用既强调语言学习过程又有利于提高学生学习成效的语言教学途径和方法。基于英语学科核心素养设计的英语课堂是教师特别是外国语学校教师值得重视和积极开展的。以牛津英语7B unit 5 welcome to the unit 教学为例，探讨通过精心设计英语课堂教学，提高学生核心素养。

综上,通过对细胞信号转导的研究，阐明Tp对结直肠癌细胞的功能影响和机制，对深入研究Tp抗结直肠癌机制有着重要提示意义。本研究拟在本次筛查的基础上进行深入机制的研究，解析雷公藤甲素对癌细胞的多方面的影响，有利于该药物的开发。

4 参考文献

[1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2016[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(1):7-30.

[2] CHEN W, ZHENG R, ZHANG S, et al. The incidences and mortalities of major cancers in China, 2009[J]. Chin J Cancer, 2013, 32(3):106-112.

[3] SONG L P, WANG H Y. Modeling and control of colorectal cancer[J]. PLoS One, 2016, 11(8): e161349.

[4] RENTSCH M, SCHIERGENS T, KHANDOGA A, et al. Surgery for colorectal cancer-trends, developments, and future perspectives[J]. Visc Med, 2016, 32(3): 184-191.

[5] ZHANG Y, CHEN Z, LI J. The current status of treatment for colorectal cancer in China: A systematic review[J]. Medicine (Baltimore), 2017, 96(40): e8242.

[6] KUPCHAN S M, COURT W A, DAILEY R J, et al. Triptolide and tripdiolide, novel antileukemic diterpenoid triepoxides from tripterygium wilfordii[J]. J Am Chem Soc, 1972, 94(20): 7194-7195.

[7] CUI J, CHEN X, SU J C. Advanced progress of main pharmacology activities of triptolide[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2017, 42(14): 2655-2658.

[8] HO L J, CHANG W L, CHEN A, et al. Differential immunomodulatory effects by Tripterygium wilfordii Hook f-derived refined extract PG27 and its purified component PG490 (triptolide) in human peripheral blood T cells: potential therapeutics for arthritis and possible mechanisms explaining in part Chinese herbal theory "Junn-Chenn-Zuou-SS"[J]. J Transl Med, 2013, 11(3): 294.

[9] PATIL S, LIS L G, SCHUMACHER R J, et al. Phosphonooxymethyl prodrug of triptolide: Synthesis, physicochemical characterization, and efficacy in human colon adenocarcinoma and ovarian cancer xenografts[J]. J Med Chem, 2015, 58(23): 9334-9344.

[10]TAMGUE O, LEI M. Triptolide promotes senescence of prostate cancer cells through histone methylation and heterochromatin formation[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2017, 18(9): 2519-2526.

[11]JIANG C, FANG X, ZHANG H, et al. Triptolide inhibits the growth of osteosarcoma by regulating microRNA-181a via targeting PTEN gene in vivo and vitro[J]. Tumour Biol, 2017, 39(4):560-568.

[12]LIU Y, SONG F, WU W K K, et al. Triptolide inhibits colon cancer cell proliferation and induces cleavage and translocation of 14-3-3 epsilon[J]. Cell Biochemistry and Function, 2012, 30(4): 271-278.

[13]郭伟健，何敏毅，孙学刚，等. 雷公藤甲素对大肠癌细胞细胞周期的调控作用[J]. 贵阳医学院学报, 2012(2): 141-144.

[14]FEITELSON M A, ARZUMANYAN A, KULATHINAL R J, et al. Sustained proliferation in cancer: Mechanisms and novel therapeutic targets[J]. Seminars in Cancer Biology, 2015, 35: S25-S54.

[15]ROSKOSKI R J. ERK1/2 MAP kinases: Structure, function, and regulation[J]. Pharmacol Res, 2012, 66(2): 105-143.

[16]SU C H, W WANG C Y, LAN K H, et al. Akt phosphorylation at Thr308 and Ser473 is required for CHIP-mediated ubiquitination of the kinase[J]. Cell Signal, 2011, 23(11): 1824-1830.

[17]WANG L, BRAUTIGAN D L. alpha-SNAP inhibits AMPK signaling to reduce mitochondrial biogenesis and dephosphorylates Thr172 in AMPKalpha in vitro[J]. Nat Commun, 2013, 4(6): 1559.

[18]LOUGHERY J, COX M, SMITH L M, et al. Critical role for p53-serine 15 phosphorylation in stimulating transactivation at p53-responsive promoters[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(12): 7666-7680.

[19]CITI V, DEL R M, MARTELLI A, et al. Phosphorylation of AKT and ERK1/2 and mutations of PIK3CA and PTEN are predictive of breast cancer cell sensitivity to everolimus in vitro[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2018,81(4):1-10.

[20]CICENAS J. The potential role of Akt phosphorylation in human cancers[J]. Int J Biol Markers, 2008, 23(1): 1-9.

[21]QIAO M, SHENG S, PARDEE A B. Metastasis and AKT activation[J]. Cell Cycle, 2008, 7(19): 2991-2996.

[22]VINCENT E E, ELDER D J, THOMAS E C, et al. Akt phosphorylation on Thr308 but not on Ser473 correlates with Akt protein kinase activity in human non-small cell lung cancer[J]. Br J Cancer, 2011, 104(11): 1755-1761.

[23]CHUNHUA L, DONGLAN L, XIUQIONG F, et al. Apigenin up-regulates transgelin and inhibits invasion and migration of colorectal cancer through decreased phosphorylation of AKT[J]. J Nutr Biochem, 2013, 24(10): 1766-1775.

[24]ZHANG W B, WANG Z, SHU F, et al. Activation of AMP-activated protein kinase by temozolomide contributes to apoptosis in glioblastoma cells via p53 activation and mTORC1 inhibition[J]. J Biol Chem, 2010, 285(52): 40461-40471.

[25]NIEMINEN A I, ESKELINEN V M, HAIKALA H M, et al. Myc-induced AMPK-phospho p53 pathway activates Bak to sensitize mitochondrial apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(20): 1839-1848.

[26]INOKI K, ZHU T, GUAN K L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival[J]. Cell, 2003, 115(5): 577-590.

[27]KIM J, KUNDU M, VIOLLET B, et al. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1[J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(2): 132-141.

[28]WU W D, HU Z M, SHANG M J, et al. Cordycepin down-regulates multiple drug resistant (MDR)/HIF-1alpha through regulating AMPK/mTORC1 signaling in GBC-SD gallbladder cancer cells[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(7): 12778-12790.

[29]VAZQUEZ-MARTIN A, LOPEZ-BONET E, OLIVERAS-FERRAROS C, et al. Mitotic kinase dynamics of the active form of AMPK (phospho-AMPKalphaThr172) in human cancer cells[J]. Cell Cycle, 2009, 8(5):788-791.

[30]ZHENG H, CHEN L, PLEDGER W J, et al. p53 promotes repair of heterochromatin DNA by regulating JMJD2b and SUV39H1 expression[J]. Oncogene, 2014, 33(6):734-744.

[31]STEGH A H. Targeting the p53 signaling pathway in cancer therapy-the promises, challenges and perils[J]. Expert Opin Ther Targets, 2012, 16(1): 67-83.

[32]MULLER P A, VOUSDEN K H. p53 mutations in cancer[J]. Nat Cell Biol, 2013, 15(1): 2-8.

[33]DUFFY M J, SYNNOTT N C, MCGOWAN P M, et al. p53 as a target for the treatment of cancer[J]. Cancer Treat Rev, 2014, 40(10): 1153-1160.

[34]LI W, LIU Y, LI X X, et al. MAPKs are not involved in triptolide-induced cell growth inhibition and apoptosis in prostate cancer cell lines with different p53 status[J]. Planta Med, 2011, 77(1): 27-31.

[35]ZHAO F, HUANG W, OUSMAN T, et al. Triptolide induces growth inhibition and apoptosis of human laryngocarcinoma cells by enhancing p53 activities and suppressing E6-mediated p53 degradation[J]. PLoS One, 2013, 8(11): e80784.

[36]ZHENG L, JIA J, DAI H, et al. Triptolide-assisted phosphorylation of p53 suppresses inflammation-induced NF-kappaB survival pathways in cancer cells[J]. Mol Cell Biol, 2017, 37(15):1128-1134.