肾间质纤维化是肾脏疾病常引起的肾组织的病理性改变，并且是不可逆转的，最终可导致终末期肾病。研究发现肾小管上皮-间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition ,EMT)是肾间质纤维化发生发展的重要机制之一[1]。EMT发生于胚胎发育、组织成形、伤口愈合、炎症修复、肿瘤的发生与转移、以及多种纤维化疾病等生理或病理条件下[2]。在EMT过程中，具有上皮表型特征如E-钙黏蛋白(E-cadherin)等表达下调，间质表型特征如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等上调[3]。本实验通过检测E-cadherin、α-SMA来了解EMT的发生。Ski(Sloan-Kettering)系一种原癌基因，参与细胞的增殖、分化、转化和肿瘤的进展，它是转化生长因子-β(TGF-β)/smad途径的阻遏因子[4-5]。本课题前期实验证实Ski在肾间质纤维化大鼠模型组中起阻遏作用，此次研究仍然利用肾间质纤维化动物模型[6-8]，并给予模型组水飞蓟宾治疗，探讨Ski在EMT的发病机制中的作用，并进一步探讨Ski与水飞蓟宾在EMT中的相关性。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

兔抗大鼠Ski多克隆(Abcam公司)，兔抗大鼠E-cadherin抗体、TGF-β1抗体、α-SMA抗体和Ⅲ型胶原(col-Ⅲ)(美国Proteintech公司)，兔抗大鼠β-actin多克隆抗体(巴傲得生物科技有限公司)，HRP标记山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物有限公司)；水飞蓟宾胶囊(天津天士力圣特制药有限公司生产，国药准字H20040299，批号750701005)，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(碧云天生物技术公司)，PVDF膜(美国Milipore公司)，化学发光液(美国Millipore公司)。

1.2 动物模型及分组

健康，雄性SD大鼠36只，8周龄，体质量200～250 g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心；大鼠适应性饲养1周后，随机均分为假手术组(S组)、模型组(U组)和治疗组(D组)。U组和D组大鼠给予10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，打开腹腔分离左侧近肾盂端输尿管，结扎并剪断输尿管；S组仅打开腹腔，分离输尿管，但不结扎、剪断。术后第1天开始予D组大鼠200 mg/(kg·d)水飞蓟宾水溶液灌胃至处死前，其余两组大鼠给予等量生理盐水处理。术后第7、14天分别处死各组大鼠(6只/组)，取左侧肾脏，去除肾包膜，纵切面切开肾脏，一部分立即置于4%多聚甲醛中固定48 h，用于免疫组化染色；一部分经液氮转移至-80 ℃冰箱中保存，用于Western blotting实验。

1.3 Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ蛋白表达

采用免疫组化法，取3 μm厚的肾脏组织切片，常规脱蜡水化，使用3% H2O2去离子水阻断内源性过氧化物酶，分别滴加Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA和col-Ⅲ一抗(浓度分别为1∶100、1∶100、1∶100、1∶150、1∶150)，4 ℃过夜， DAB显色、苏木素复染，阴性对照用PBS代替一抗。阳性结果表现为肾小管上皮细胞胞浆、肾小球及肾间质内呈棕黄色或褐黄色的颗粒样物质，每张切片在200倍光学显微镜下单盲分别在左上、左下、右上、右下和中间各取1个视野，采用Image-Pro Plus 6软件测量阳性区域的平均光密度值，表达信号越强，平均光密度值越高。肾脏组织匀浆采用Western Blot法，取-80 ℃保存的各组大鼠肾组织约100 mg蛋白裂解液法提取总蛋白，BCA法定量；制备蛋白质样品，经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上，加入Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ及β-actin(对照)一抗工作液(浓度分别为1∶200、1∶1 000、1∶600、1∶600、1∶1 000及1∶6 000), 4 ℃过夜，洗膜后加入HRP 标记的山羊抗兔二抗(1∶20 000)，室温孵育1 h。洗膜、ECL 显色，上海勤翔凝胶成像系统扫描、imaje J软件分析获得各条带灰度值(β-actin作为内参)，计算目标蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示。方差齐者，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，组间两两比较用LSD法；如方差不齐，采用Tamhane′s T2法；采用Pearson相关分析Ski与TDI、TFI、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA以及col-Ⅲ表达的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织中Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ蛋白的平均光密度值

Ski作为一种原癌基因，在人体细胞中鉴定出其同源基因C-Ski 位于细胞核内，是一个进化上高度保守的蛋白质，它在神经系统、肌肉组织、造血细胞及成纤维细胞的发育与分化中及在肿瘤发生、创伤愈合、肝再生等病中发挥作用，参与多种细胞过程[4，11]。C-Ski 具有抗纤维化的作用，可调节心肌纤维母细胞的表型及收缩功能[12]。有研究发现，c-ski在动脉内皮系统中通过抑制Vimentin、Snail、Slug和Twist的表达，以增强CD31的表达，阻止内皮间充质转分化(EndMT)的发生[13]。水飞蓟宾临床上被广泛应用肝炎、肝硬化、肝纤维化等肝脏疾病的治疗，具有抑制多种癌细胞的作用，通过对多种癌细胞信号通路的影响调控EMT以抑制肿瘤细胞的转移[15-17]。

  

注：A为Ski， B为E-cadherin，C为TGF-β1，D为α-SMA，E为Col-Ⅲ；(1)与同时点S组比较，P<0.05； (2)与D7组比较，P<0.05 ；(3)与同时点U组比较，P<0.05图1 各组大鼠Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅲ光密度值Fig.1 Optical density values of Ski, E-cadherin, TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅲ of rats in each group

2.2 肾脏组织匀浆中Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ蛋白的相对表达量

Western Blot显示，与S组同时间点比较，U组的Ski、E-cadherin表达下降，U14比U7下降明显(P<0.05)，而U组的TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ表达上升，U14比U7上升明显(P<0.05)；与U组同时间点比较，D组的Ski、E-cadherin表达上升，D14比D7上升明显(P<0.05)，而D组的TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ表达下降，D14比D7下降明显(P<0.05)。见图2和表1。

  

图2 各组大鼠肾脏组织匀浆中Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ蛋白的表达(Western Blot)Fig.2 Expression of Ski, E-cadherin, TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅲ from kidney tissue homogenate of rats in each group(Western Blot)

2.3 Ski与E-cadherin、TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅲ的相关性

肾间质纤维化(RIF)与功能性肾实质减少密切相关，是由多种细胞因子和信号通路介导，以肾小球和间质区域的细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)蛋白的异常和过度沉积为典型特征，最后引起肾脏组织结构破坏及其功能丧失。肾脏损伤后，在炎性介质和促纤维化因子作用下，肾小管上皮细胞向间充质细胞转换(EMT)[9]。EMT 指上皮细胞向间充质细胞转化的现象，发生于胚胎发育、组织成形、伤口愈合、炎症修复、肿瘤的发生与转移和多种纤维化疾病等多种生理或病理条件下[10]。在EMT过程中，多种信号分子参与其中并发挥重要作用。EMT是一个有序的发生过程，是指在特定的生理或病理条件下，不能移动的上皮细胞转化为间质细胞的生物学过程，包括上皮细胞极性消失和黏附性降低，其特异性蛋白E-cadherin、角蛋白、紧密连接蛋白表达量下调，同时间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin) 和纤连蛋白(FN) 表达增加，并伴有平滑肌肌动蛋白α(α-SMA) 和成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1) 的表达及肌动蛋白重组[3]。肾脏损伤后调节EMT 的关键信号通路如TGF-β1/Smad、ILK、Wnt/β-catenin 以及Snail1 被激活，使具有极性的肾小管上皮细胞表面标志物(如E-cadherin) 逐渐消失，并逐渐获得间叶细胞或肌成纤维细胞(myofibroblasts，MF) 表型(如α-SMA、波形蛋白) ，细胞迁移和侵袭力增强，最终穿过破坏的基底膜到达间质区域，产生大量ECM，导致肾功能不可逆性损害。MF是RIF形成的中心环节[9]。本实验通过检测E-cadherin、α-SMA来了解EMT的发生。

3 讨论

 

表1 大鼠肾脏组织匀浆中Ski、E-cadherin、TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ蛋白的相对表达量(Western Blot)Tab.1 Expression of Ski, E-cadherin, TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅲ from kidney tissue homogenate of rats

  

蛋白相对表达量S7S14U7U14D7D14Ski0.803±0.117 0.892±0.0950.331±0.045(1)0.228±0.057(1)(2)0.434±0.062(1)(3)0.548±0.079(1)(3)E-cadherin0.617±0.0890.672±0.1520.217±0.085(1)0.237±0.073(1)(2)0.487±0.123(1)(3)0.501±0.152(1)(3)TGF-β10.291±0.07640.282±0.08480.740±0.071(1)0.942±0.106(1)(2)0.626±0.094(1)(3)0.495±0.068(1)(3)α-SMA0.221±0.0540.262±0.0690.826±0.1551)1.029±0.122 (1)(2) 0.643±0.107(1)(3)0.458±0.067(1)(3)Col-III0.270±0.0620.286±0.0240.740±0.077(1) 0.915±0.102(1)(2)0.641±0.084(1)(3)0.462±0.086(1)(3)

(1)与S组同时点比较，P<0.05；(2)与同组第7天比较，P<0.05；(3) 与U组同时点比较，P<0.05

  

图3 各组大鼠Ski与E-cadherin、TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅲ相对表达量的相关性分析Fig.3 Correlation analysis between Ski and E-cadherin, TGF-β1, α-SMA as well as Col-Ⅲ in rats

Persson相关分析表明，Ski平均光密度值与E-cadherin呈正相关(r=0.822，P<0.01)，与TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅲ呈负相关(r分别-0.8880、-0.802、-0.814，P<0.01)；Ski灰度值与E-cadherin呈正相关(r=0.845，P<0.01)，与TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅲ呈负相关(r分别为-0.869、-0.894、-0.903，P<0.01)。见图3。

前期实验显示，模型组大鼠肾脏出现肾间质纤维化，而治疗组给予水飞蓟宾灌胃，结果显示各时间点肾脏病变程度均较同期模型组减轻，较假手术组重[6]；治疗组较模型组TDI和TFI评分有所降低，第14天时变化更大(P<0.05)[6]。本实验免疫组化显示Ski位于细胞核内，正常肾脏中其蛋白表达中等，在纤维化模型组Ski表达明显减少，随时间进展更为明显；而通过水飞蓟宾治疗后Ski蛋白上调，且第14天上升更明显，说明水飞蓟宾能上调Ski蛋白。在模型组中，Ski、E-cadherin同时下调，而α-SMA上调， Pearson相关分析显示，Ski蛋白表达与TGF-β1、α-SMA、Col-III均呈显著负相关，与E-cadherin表达呈显著正相关,提示SKi可能参与了肾间质纤维化EMT的发生。

2015—2017年ILI监测数据来源于中国疾病预防控制信息系统；同期气象资料来源于舟山市市气象局，包括平均气温、平均气压、相对湿度、总雨量、总日照、平均风速、水汽压。

EMT最早期改变就是E-cadherin 的表达抑制，E-cadherin属于I型钙黏蛋白，是上皮细胞的表现特征之一，实现细胞间的黏附连接，并维持上皮细胞的多种功能。随着 E-cadherin的丢失，细胞间的紧密连接遭到破坏，使上皮细胞失去粘附特性，E-cadherin介导的细胞-细胞的粘附功能丧失被认为是EMT 的关键步骤。α-SMA 是肌成纤维细胞的标志，肌成纤维细胞是成纤维细胞的活化形式，也是细胞外基质包括胶原成分的重要来源。胶原是细胞外基质(ECM) 的主要蛋白质成分，胶原含量多少可以直接反应肾纤维化程度的轻重[10]。

Kubellk - Munk理论认为:可以用颜料本身的散射系数S和吸收系数K两个参数来说明涂层光学特性。同时提出了如下假定条件[5]:

免疫组化显示，S组肾组织中，Ski主要表达在肾小管上皮细胞核内，E-cadherin主要表达于肾小管上皮细胞、表达较高，而TGF-β1、α-SMA和col-Ⅲ阳性染色在细胞间质中表达较少。U组大鼠肾组织中Ski、E-cadherin平均光密度值较同时间点S组降低(P<0.05)，但TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ平均光密度值较同时间点S组增加(P<0.05)，在肾小管间质尤为明显。D组大鼠肾组织中Ski、E-cadherin平均光密度值表达较同时间点U组增加(P<0.05)，但TGF-β1、α-SMA、col-Ⅲ平均光密度值表达较同时间点U组降低(P<0.05)。见图1。

宫颈与子宫、乳腺等器官均是雌、孕激素发生生物学效应的靶器官，其功能、代谢和细胞增殖等均受到雌、孕激素的调节和影响。近年来国内外学者的研究报道均证明子宫内膜癌与乳腺癌的治疗及预后与ER、PR的表达状态存在密切的相关性，由此我们推论子宫颈癌的发生、发展和受雌、孕激素影响的其他靶器官一样，是否会受到雌、孕激素的影响? 近年来有学者认为宫颈癌中的AC对雌激素较为敏感，是激素依赖性肿瘤，类似于子宫内膜癌，手术时必须同时切除双侧附件。而目前对AC给予HRT治疗安全性的研究国内外甚少。本研究旨在探讨早期AC患者是否可行手术保留附件及术后给予HRT治疗提供一定的参考依据。

他进入客厅，见卧室门从里面锁死，便从窗户爬进卧室，发现薛教授已经死在床上。房间内一切如常，锁孔上还插着一把钥匙。钥匙上留下的拇指、食指指纹同薛教授的指纹一致，看起来像是他反锁门后自杀的。

本实验显示水飞蓟宾治疗后Ski蛋白上调，TGF-β1表达抑制，同时E-cadherin蛋白表达增加，这在一定程度上避免了上皮细胞粘附及极性的丢失。E-cadherin表达增加随之阻遏EMT发生；并且通过上调Ski蛋白，使TGF-β/smad信号通路受抑制，进而间接抑制α-SMA，这就阻止间充质细胞的形成，抑制肾小管上皮细胞和间质细胞发生表型转变(EMT)。此外水飞蓟宾治疗组中Col-Ⅲ的改善说明肾纤维化程度得以改善。

TGF-β是EMT的主要诱导剂，当TGF-β1受到炎症、损伤等刺激后[18]，与TGF-βII型受体(type II TGF-βreceptor，TGFβR2)紧密结合形成复合物，接着募集TGF-βI型受体(type I TGF-βreceptor，TGFβR1)，并促使其发生磷酸化，激活其丝氨酸/苏氨酸激酶活性，活化的TGFβR1可以使smad2/3磷酸化，激活其转录活性，磷酸化的smad2/3与smad4形成复合物进入细胞核，随后引起E-cadherin的下降和α-SMA的升高[19]。Ski位于细胞核内，高度保守，它是TGF-β的重要阻遏子，通过阻止Smad2、Smad3磷酸化以及阻止磷酸化smad3与smad4结合形成有活性的smad复合物，以及募集大量辅助抑制子，从而阻断TGF-β/smad途径对靶基因的转录调控。此外Ski可作为TGFβR1直接的拮抗剂发挥功能作用。同时除了Smad经典通路，Ski还可影响Akt和p38MAPK等非smad依赖的TGF-β旁路途径。与非小细胞肺癌的研究类似[20]，Ski直接与smad蛋白作用，阻止smad2/smad3的磷酸化，显著抑制TGF-β介导的EMT和肿瘤侵袭。Vincent等[21]发现研究在TGF-β诱导的EMT过程中，Smad3和Smad4蛋白能够与Snail形成转录复合体，靶向结合到E-cadherin启动子区从而控其基因转录表达。

总之，本实验显示，水飞蓟宾可能通过上调Ski而抑制TGF-β1的表达，从而影响EMT的发生，可能具有一定的抗纤维化作用。

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