癫痫是多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所致的临床综合征，长期、反复的癫痫发作严重降低患者的生活质量，因而明确癫痫的发病机制及寻求新的治疗靶点具有重要的现实意义。大脑几乎是单一的通过线粒体呼吸链的有氧代谢获取能量，使其非常容易受到氧化应激损伤，提示氧化应激在癫痫病理生理学中有着重要作用。有些特定的遗传性癫痫和线粒体功能障碍有关，如颞叶癫痫[1]。大量国内外研究[2-5]证实，癫痫过程中存在线粒体功能及结构损伤。Miro1为线粒体衔接蛋白，在神经细胞中已通过免疫沉淀方法证实Miro1与Milton(另一种线粒体衔接蛋白)形成复合物并与马达分子Kinesin肌球重链连接，调控线粒体沿微管的移动[6-7]，将受损线粒体逆行运动至胞体被降解和回收，同时将正常线粒体顺向运动至神经元的作用部位，降低氧化应激损伤，发挥正常功能。据此推测，是否能通过调控线粒体移动，维持线粒体正常结构及功能，降低氧化应激损伤，进而发挥癫痫神经保护作用。本研究利用体外培养海马神经元癫痫放电，构建腺病毒真核表达质粒干预线粒体衔接蛋白Miro1表达，研究Miro1蛋白对线粒体氧化应激损伤的保护作用及其机制，探讨能否通过介导线粒体移动，减少线粒体氧化应激损伤发挥癫痫神经保护作用，为临床癫痫的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

VRIO模型最早由杰恩·巴尼提出[12]。在《从内部寻求竞争优势》一文中，巴尼概括了该模型的核心思想：可持续竞争优势不能通过简单地评估环境机会和威胁，然后仅在高机会、低威胁的环境中通过经营业务来创造，它还依赖于独特的资源和能力，企业可把这些资源和能力应用于环境竞争中。他认为，判断企业特定的资源和能力是优势还是劣势需要回答以下四个问题：(1)企业的资源和能力通过开发机会和抵御威胁能否增加价值？(2)有多少竞争企业已经获得了这些有价值的资源和能力？(3)与已经获得资源和能力的企业相比，不具有某些资源和能力的企业是否面临获取它的成本劣势？(4)企业是否被组织起来开发利用其资源和能力？

将情景教学应用在护理带教服务当中,可以有效的提高护理实习生在专业知识方面的掌握程度、实践操作能力以及应急能力等多方面的能力,在制定计划时可以评估患者的综合素质,并将患者所存在的共性、个性问题进行针对性考虑和分析,将改进措施规划在循环计划当中,并实施计划,借助和实习生共同制定的计划进行护理教学,可以显著提升护理教学的价值与意义,同时借助情景教学可以实现护理教学质量的循环性提升作用,达到一个良性循环,从而实现不断提升护理实习生护理能力的目标[4]-[5]。

1.1.1 实验动物 新生24 h以内的SD大鼠80只，SPF 级[郑州大学动物实验中心提供，许可证号SCxK(豫)2010-0002]。

近年来，我国职业教育逐步重视培养学生职业技能、就业能力，国家对于职业教育的规划是以提高教学质量为重点，培养学生的创新、创业能力。职业技能大赛是检验职业教育成果的一种形式，可通过开展职业技能大赛来提高职业教育的教学质量。贵州电子信息职业技术学院近几年积极参加移动通信职业技能大赛，如2015年和2016年举办的全国高职“4G全网建设技术”大赛，本文结合该校参加移动通信职业技能大赛的经验、体会，探讨移动通信职业技能大赛对职业院校通信人才培养的影响。

1.1.2 主要试剂 Neurobasal Medium(Gibco公司)、DMEM/F-12(Gibco公司)、特级胎牛血清(Gibco公司)、PBS 液(HyClone公司)、牛胰岛素(Sigma公司)、L-多聚赖氨酸(Sigma公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、B27(Gibco公司)、 Glutamax-Ⅰ谷氨酰胺(Gibco公司)、青链霉素混合液(北京索莱宝);RIPA裂解液(碧云天)；兔抗大鼠NSE多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司); 山羊抗兔 IgG/Cy3 荧光二抗 (北京博奥森生物技术有限公司); Dylight 594标记山羊抗兔荧光二抗(中杉金桥); 兔抗大鼠Miro1抗体(Abcam公司); 兔抗大鼠ND6抗体(美国Santa Cruz公司)；靶向大鼠Miro1基因的shRNA重组腺病毒真核表达质粒及对照腺病毒载体(吉凯基因公司)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所)，还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2.5 免疫荧光法检测ND6蛋白表达变化 海马神经元在放置有爬片的24孔板中生长至14 d后，PBS漂洗后用4%多聚甲醛固定;0.5%Triton X-100室温通透20 min，在玻片上滴加正常胎牛血清，室温封闭；每张玻片滴加足够量的稀释好的兔抗大鼠ND6抗体， 4 ℃孵育过夜。PBST 浸洗爬片，滴加稀释好的Dylight 594标记山羊抗兔荧光二抗，湿盒中孵育，PBST浸洗爬片。滴加DAPI避光孵育，对标本进行染核，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。运用ImageProPlus(IPP)图像处理分析软件分析，以累积OD(IOD)作为目的蛋白的相对表达量。

采用 F3流变发酵仪对空白及添加复合酶的全麦面团流变发酵特性进行测定[14]。称取300 g加酶全麦馒头粉，向其中加入3 g酵母，混匀。加入适量水，边加边用筷子搅拌成均匀面絮；使用和面机最低档和至面絮成团，再换1档和面10 min，称取315 g和好的面团放入发酵篮中进行测定。测试在30 ℃下进行，负重砝码为0 kg，测试时间为3 h。每个样品重复测试2次，最终结果取平均值。

2.1 原代大鼠海马神经元形态学特征 见图1。倒置差相显微镜下观察到海马神经元培养至14 d时海马神经元体积变大，树突及轴突清晰可见，细胞之间联系紧密。

1.2.4 Western blot 法检测Miro1、ND6蛋白表达 提取各组海马神经元蛋白，BCA法测蛋白浓度，调整上样量，每个泳道保证总蛋白量相等。SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳结束后将胶上的蛋白质条带转移到PVDF膜上(半干转)，5%脱脂奶粉封闭3 h。一抗孵育，兔抗大鼠Miro1抗体(1∶1000)，兔抗大鼠ND6抗体 (1∶200)，4℃ 冰箱过夜。TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(1∶5000)，室温摇床缓慢孵育1 h，ECL显影成像重复3次。采用ImageJ测定条带光密度，以目的蛋白与相应内参条带光密度(OD)比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.3 NSE染色鉴定海马神经元 海马神经元在放置有爬片的24孔板中生长至14 d后，进行NSE鉴定。吸弃培养基后用4%多聚甲醛固定,0.25%Triton穿孔15 min;1% BSA 室温下封闭30 min，加入兔抗大鼠NSE 多克隆抗体(稀释200倍)4 ℃过夜，TBST漂洗3次后加入山羊抗兔IgG/Cy3荧光二抗，以下操作步骤均需避光进行，TBST漂洗，DAPI染色，吸弃DAPI，TBST漂洗，抗荧光猝灭封片剂封片，放入湿盒避光保存，择期在荧光显微镜下观察。荧光显微镜下随机选择10个视野，以视野中阳性神经元数目占观察细胞总数的百分率为神经元纯度。

1.2 方法

1.2.6 比色法测MDA、GSH蛋白浓度 提取各组海马神经元蛋白，离心取上清液，分别于532 nm、420 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零比色测各管OD值，计算MDA、GSH蛋白浓度。

1.2.7 统计学方法 所有数据资料以均数±标准差表示，采用 SPSS 21.0单因素方差分析及LSD-t检验处理数据。

2 结 果

1.2.2 分组及处理 海马神经元培养至14 d，随机分为对照组(CON组)、无镁诱导组(AE组)、AE+对照腺病毒组(AE+rAd组)、AE+shRNA腺病毒组(AE+rAd-Miro1-shRNA组)，每组5份。 CON组用正常细胞外液培养3 h后，更换为正常维持液继续培养, AE组以无镁细胞外液作用3 h后，更换为正常维持液，其中AE+rAd转染组、AE+rAd-Miro1-shRNA转染组于无镁诱导48 h前分别转染用维持液稀释好后的不表达任何外源基因的对照腺病毒、靶向大鼠Miro1基因的shRNA重组腺病毒真核表达质粒,并分别于造模后24 h终止细胞培养，用于后续试验。

1.2.1 原代海马神经元的培养 新生24 h内的SD大鼠，常规消毒断头取脑,分离双侧海马，剔除表面血管，并剪成的组织块转移至离心管中，加入0.125% 的胰酶消化完毕后加入PBS终止消化，1500 r/min 离心5 min，弃上清，洗涤后加入种植液制成细胞悬液。取少量细胞悬液用于台盼蓝染色计数，调整细胞密度为 5×105/ml，接种于6孔培养板中(预先以0.01% L-多聚赖氨包被)。培养24 h后等量换成维持液继续培养，以后每3 d半量换维持液1次，并于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，培养至 14 d的海马神经元可用于后续实验。

2.3 各组海马神经元中Miro1蛋白表达的比较 见表1。与CON组比较，AE组、AE+rAd组大鼠海马神经元Miro1表达明显升高，AE+rAd-Miro1-shRNA组大鼠海马神经元Miro1表达明显降低(均P<0.05)。AE+rAd-Miro1-shRNA组大鼠海马神经元Miro1表达明显低于AE组和AE+rAd组(均P<0.05)。

  

图1 倒置相差显微镜下观察到体外培养14 d的海马神经元形态 图2 培养至14 d的海马神经元NSE免疫荧光染色(×400)

2.2 海马神经元纯度测定结果 见图2。海马神经元培养至14 d，经神经元特异性烯醇化酶 NSE 染色鉴定，纯度为90%以上。

  

表1 各组海马神经元中Miro1及ND6蛋白表达的比较(x±s，n=10)组别Miro1(OD值)ND6(OD值)ND6(IOD值)CON组0．2099±0．02350．6914±0．03081646976．38±142960．39AE组0．3532±0．0370∗0．2955±0．0270∗364597．40±31805．07∗AE+rAd组0．3714±0．0304∗0．2721±0．0351∗286507．90±33900．71∗AE+rAd⁃Miro1⁃shRNA组0．1201±0．0298∗△▲0．1166±0．0266∗△▲125793．00±23432．60∗△▲ 注：与CON组比较∗P<005；与AE组比较△P<005；与AE+rAd组比较▲P<005

2.4 各组海马神经元中ND6蛋白表达的比较 见表1。与CON组比较，AE组、AE+rAd组、AE+rAd-Miro1-shRNA组大鼠海马神经元ND6表达明显降低(均P<0.05)。AE+rAd-Miro1-shRNA组大鼠海马神经元ND6表达明显低于AE组和AE+rAd组(均P<0.05)。

2.5 各组海马神经元中MDA及GSH蛋白浓度的比较 见表2。与CON组比较，AE组、AE+rAd组、AE+rAd-Miro1-shRNA组大鼠海马神经元MDA蛋白浓度明显升高，GSH蛋白浓度明显降低(均P<0.05)。AE+rAd-Miro1-shRNA组大鼠海马神经元MDA蛋白浓度明显高于，GSH蛋白浓度明显低于AE组和AE+rAd组(均P<0.05)。

敲除BLM基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞株的构建 ………………………… 黄晏军，等(5):503

  

表2 各组海马神经元中MDA及GSH蛋白浓度的比较(x±s，n=10)组别MDA(nmol/ml)GSH(mg/g)CON组4．47±0．93 2．10±0．21 AE组8．33±1．06∗1．14±0．23∗AE+rAd组9．46±2．36∗1．06±0．32∗AE+rAd⁃Miro⁃shRNA组11．30±0．55∗△▲0．80±0．10∗△▲ 注：与CON组比较∗P<005；与AE组比较△P<005；与AE+rAd组比较▲P<005

3 讨 论

癫痫发作中脑部神经元的高度同步化异常放电，引起呼吸链电子漏出活性氧(ROS)增加,导致神经元对痫性损伤更敏感，形成恶性循环，因此及时清除受损线粒体和维持线粒体正常功能至关重要[8]。线粒体沿微管移动，通过马达分子如Kinesin提供机械动力来促进其较远距离的移动。这些马达分子与线粒体衔接蛋白共同构成较为复杂的动力系统，其中衔接蛋白Miro1为该动力系统中较为核心的部分。目前多种神经系统退行性疾病的发病机制都涉及线粒体移动，如帕金森病(PD)相关蛋白PINK1/Parkin通路可以作用于线粒体移动蛋白Miro，受损线粒体的不正常运输是PD致病原因的可能性之一[9]。结合本实验结果，无镁致痫后海马神经元Miro1反应性增高，表明Miro1蛋白介导的线粒体运输参与海马神经元致痫过程。致痫过程氧化应激产物增加，Miro1介导的线粒体运动在一定程度上保护了神经元正常功能，但增加的ROS导致mtDNA损伤，最终导致氧化反应与抗氧化反应失衡，神经元氧化应激损伤加重。转染 rAd-Miro1-shRNA病毒后海马神经元 Miro1蛋白表达显著降低，致痫海马神经元氧化应激损伤进一步加重，表明Miro1介导的线粒体运输功能降低可加重致痫海马神经元的氧化应激损伤，进而说明Miro1对致痫海马神经元发挥保护作用。

线粒体呼吸链膜蛋白复合体1(NADH脱氢酶)是线粒体呼吸链电子传递系统的主要入口，其亚基ND6蛋白由线粒体基因(mtDNA)编码。NADH脱氢酶是线粒体中ROS产生的主要位点，因此mtDNA对于ROS所致损伤非常敏感[10-12]。本研究表明，无镁致痫后海马神经元ND6蛋白表达降低，说明致痫海马神经元中线粒体电子链复合体损伤，其可能的原因是致痫过程产生的ROS对线粒体复合体亚基造成直接损伤，导致ND6蛋白表达减少。抑制miro1表达后，致痫海马神经元中ND6表达进一步降低，推测由于miro1介导的线粒体运输减少，ATP生成障碍，进一步加重线粒体功能障碍，最终导致神经元对痫性损伤更加敏感。因此致痫海马神经元中提高Miro1介导的线粒体移动对维持线粒体正常功能，发挥致痫神经元的保护作用至关重要。

时值冬季，天气逐渐寒冷，宝宝稍不注意“小肚子”就会着凉，尤其是年龄较小的宝宝，拉起肚子来往往让宝妈们措手不及又心疼不已。

MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量可反映脂质过氧化反应的程度，是最常用的脂质过氧化损伤标记物。GSH是一种抗氧化剂，清除细胞内氧自由基，保护细胞膜的完整性。相关研究[13-14]表明，致痫海马神经元氧化及抗氧化状态是失衡的，氧化应激增加，GSH水平降低，脂质过氧化增加。本研究结果显示，无镁致痫后海马神元MDA表达升高，GSH表达降低，线粒体产生氧化应激损伤，转染 rAd-Miro1-shRNA病毒抑制海马神经元Miro1蛋白表达后， MDA蛋白表达进一步升高，GSH蛋白表达进一步降低。表明抑制Miro1表达后，致痫海马神经元脂质过氧化物增多，氧化应激损伤进一步加重。本实验中致痫海马神经元线粒体复合体Ⅰ亚基ND6蛋白受损，产生氧自由基增多可能是产生氧化应激损伤的原因。抑制Miro1表达后线粒体功能障碍加重，产生强烈的氧化应激损伤，表明Miro1介导的线粒体移动可能通过保护线粒体复合体功能，减少脂质过氧化物生成，增加抗氧化物酶类水平发挥神经保护作用。但此研究仅通过测定神经元细胞中Miro1的表达变化来推测其保护作用机制，缺乏电镜等直接影像学证据，需进一步完善。

[参 考 文 献]

[1] 杨娟,王文敏. 癫痫发作和氧化应激的研究进展[J]. 昆明医学院学报, 2012, 33: 232.

[2] Gao J. Mitochondrial dysfunction and ultrastructural damage in the hippocampus of pilocarpine-induced epileptic rat[J]. Neurosci Lett, 2007, 411: 152.

[3] Han Y. Impaired mitochondrial biogenesis in hippocampi of rats with chronic seizures[J]. Neuroscience, 2011, 194: 234.

[4] Acharya MM, Katyare SS. Structural and functional alterations in mitochondrial membrane in picrotoxin-induced epileptic rat brain[J]. Exp Neurol, 2005, 192: 79.

[5] Folbergrova J, Kunz WS. Mitochondrial dysfunction in epilepsy[J]. Mitochondrion, 2012, 12: 35.

[6] Fransson A, Ruusala A, Aspenstrom P. Atypical Rho GTPases have roles in mitochondrial homeostasis and apoptosis[J]. Biol Chem, 2003, 278: 6495.

[7] Glater EE. Axonal transport of mitochondria requires milton to recruit kinesin heavy chain and is light chain independent[J]. Cell Biol, 2006, 173: 545.

[8] Lin Y. Mitochondrial DNA damage and the involvement of antioxidant defense and repair system in hippocampi of rats with chronic seizures[J]. Cell Mol Neurobiol, 2010, 30: 947.

[9] Wang X. PINK1 and Parkin target Miro for phosphorylation and degradation to arrest mitochondrial motility[J]. Cell， 2011, 147: 893.

[10] 李凤杰,沈丽君,方合志,等. 线粒体呼吸链复合体Ⅰ[J]. 中国细胞生物学学报,2014,36:1153.

[11] 谢南昌,陈晨,王翠,等. 线粒体分裂蛋白抑制剂对小胶质细胞氧化损伤的保护作用[J]. 神经损伤与功能重建, 2014, 9: 464.

[12] 李强,翟宇,张婷,等. 脑缺血再灌注后线粒体氧化应激损伤的动态变化[J]. 中国临床神经科学, 2014, 22: 241.

[13] Yis U, Kin E, Kurul SH, et al. Effects f epilepsy and valproic acid on oxidant tatus in children with idiopathic epilepsy [J]. Epilepsy Res， 2009, 84: 232.

[14] Freit R, Nascimento KGD, Ferreira PMP. Neurochemical changes on oxidative stress in rat hippocampus duringacute phase ofpilocarpine- induced seizures[J]．Pharmacol Biochem Be， 2010， 94: 341.