糖尿病患者有低血糖的风险，尤其在严格控制血糖的患者中。低血糖具有迅速且严重的危害，轻者表现为精神异常，重者昏迷或者死亡。目前临床对于低血糖的治疗是尽快升高血糖。一个偶然的机会，笔者在研究糖尿病对大鼠血-脑屏障影响实验[1]中意外地发现，大鼠低血糖纠正的速度越快，脑组织损伤越重。这一现象与目前临床尽快纠正低血糖的治疗现状相矛盾。因此，本实验通过动态监测大鼠脑组织超微结构和部分氨基酸浓度的变化探讨血糖升高速度对大鼠低血糖性脑损伤的影响。

“用良心做技术，用爱心做服务，农民的需求就是我们服务的动力。”瑞丰生态土壤修护研究院院长曹凯表示，瑞丰生态土壤研究院通过对全国各地土壤情况的深度分析调研，积累了大量的土壤数据，从而为产品研发和套餐化种植解决方案的打造提供了强大的基础支撑，形成为土壤及作物量身定制的产品与服务，使产品的利用率和服务效果得以最大化的提升，切实帮助农民增产增收，扎实推进土壤修护事业。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 生物合成人胰岛素(诺和灵R，丹麦诺和诺德公司)，871482/7型微量输液泵(德国Braun公司)，透射电镜(H-7650B型，日本日立公司)，FM3545型微型牙科钻(美国Foredom公司)，68001型大鼠立体定位仪(美国Stoelting公司)，CMA12/4 cm微透析探针及探针套管，谷氨酸(Glu，≥99%)，天冬氨酸(ASP，≥99%)，GABA(≥99.5%)。

公共图书馆的人才需求量仅次于本科院校图书馆。公共图书馆招聘信息共有185条，占所有招聘信息的36．7%。近年来，国家层面上，随着免费开放政策的推行以及《公共图书馆建设用地标准》等文件的实施，公共图书馆的硬件条件取得了较大发展。地方层面上，地方政府及有关部门积极探索总分馆模式建设，努力克服区县一级图书馆财政保障不足的困境，出现了岭南模式、嘉兴模式等。在人才需求方面，与本科院校图书馆相比，公共图书馆具有法人代表资格，独立性更大，因此公共图书馆的招聘更加规范、多元、灵活。

1.2 方法

1.1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠由上海市第六人民医院动物实验中心提供，体质量250～300 g。大鼠禁食12 h, 腹腔注射链脲佐菌素(STZ, S0130, Sigma公司, 50 mg/kg溶于pH值4.4、0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中), 自由进食进水, 72 h后测随机血糖, 采用简单随机抽样分组的方式选取连续3次血糖>16.67 mmol/L的糖尿病模型大鼠15只，平均分为假手术组(Sham组)、低血糖后快速再灌注组(Fast组)、低血糖后慢速再灌注组(Slow组)。

2.1 各组大鼠颞叶皮质神经细胞突触的超微结构比较 在低血糖前，Sham组突触前膜、突触后膜、突触间隙清晰可见(图1A)。在葡萄糖胰岛素混合液灌注后，Sham组突触前膜、突触后膜不清晰，多数有融合，突触间隙模糊不清(图1B)。在葡萄糖再灌注后，Fast组突触前膜、突触后膜不清晰，多数有融合，突触间隙模糊不清(图1C)。在葡萄糖再灌注后，Slow组突触前膜、突触后膜尚清晰，突触间隙大致正常，少数有融合，突触小泡增多不明显(图1D)。

1.2.2 微透析样品制备 用超纯水浸泡干式保存的微透析探针，透析膜湿润后用林格液灌流，确定微透析探针针尖没有气泡，透析膜内林格液处于流动状态。大鼠保持固定不动，从微透析探针套管中取出假针，插入微透析探针，将动物固定并放入清醒动物活动装置中，固定管路后保证动物可自由活动。打开微量注射泵，林格液流速为1 μl/min，弃去最初的30 L透析液，在低温收集器中收集微透析样品，每30 min为一个流份，样品量30 L。

1.4 统计学方法 选择SPSS 19.0软件分析和统计本实验相关数据，计数资料选择卡方检验，计量资料则选择t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.2.4 游离氨基酸含量的测定 层析及荧光层析图谱建立：用微量加样器在7 cm×7 cm聚酰胺薄膜上进行单项层析，然后在30 nm层析灯下确定各种游离氨基酸的位置。游离氨基酸的定量检测：将待测的各种游离氨基酸荧光斑点剪下，加重蒸甲醇2 ml浸泡4 h后，用650-60荧光分光光度计定量检测，其条件为：狭缝5 nm，激发波360 nm，发射波510 nm。

1.2.5 统计学方法 使用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料使用均数±标准差表示，各组之间的计量资料采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

1.2.1 低血糖动物模型制作及处理 所有大鼠实验前禁食12 h，称体质量，使用罗氏ACCU-CHEK血糖仪测血糖。大鼠经腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，备皮，暴露头部囟门附近面积1～2 cm2的皮肤，切开皮肤，钝性分离皮下组织并擦净，暴露骨面。用立体定位仪固定大鼠头部，标出前囟点，记录前囟点各方向的坐标。在纹状体对应的点(AP+0.1 mm，ML-2.5 mm，DV-8.0 mm)用牙科钻打孔，另钻两孔拧入螺丝钉；在钻孔点植入微透析套管，用牙科水泥将套管连同两个螺钉一并固定。待牙科水泥牢固后，松开立体定位仪，洒入少量注射用青霉素钠粉末，手术区域前后各缝皮一针。用颈部塑料套圈束在大鼠颈部，松紧适宜，术后观察24 h，正常饲水食。所有大鼠给予盐酸氯胺酮注射液腹腔注射，待大鼠充分麻醉后，固定，取左侧腹股沟手术刀切开1.5 cm切口，以眼科手术镊分离出股静脉，将BD密闭式静脉留置针以45°插入股静脉，拔出针芯。Sham组大鼠给予股静脉注射25%葡萄糖和15 U/kg的胰岛素1.5 ml/h，维持血糖在(5.50±0.25)mmol/L的正常范围5 h。Fast组和Slow组大鼠经股静脉以1 U/h的速度泵入胰岛素诱导低血糖，使血糖水平在1.0～1.5 mmol/L后维持1 h。参考徐周伟等[2]的研究设计，Fast组大鼠低血糖后用静脉输液泵，经股静脉给予25%葡萄糖，以2.8～3.0 ml/h，在5～10 min内，将血糖水平升至5～6 mmol/L并维持稳定1.5 h；Slow组大鼠低血糖后经股静脉给予25%葡萄糖，以1.2～1.4 ml/h ，在20～30 min内，将血糖水平升至5～6 mmol/L并维持稳定1.5 h。实验过程中，用多道生理信号采集处理系统(RM-6240BD/CD，成都仪器厂)对大鼠的血压进行监测，有2只大鼠低血糖过程中出现收缩压低于90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，被剔除出实验。

2.2 各组大鼠葡萄糖再灌注前、后氨基酸水平的比较 见表1、图2。与低血糖前相比，低血糖后各组大鼠脑组织天冬氨酸、谷氨酸和GABA浓度均升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。Fast组和Slow组葡萄糖再灌注后脑组织谷氨酸、天冬氨酸和GABA浓度明显低于低血糖后，亦低于Sham组葡萄糖胰岛素混合液灌注后(均P<0.05)。在葡萄糖再灌注后， Slow组脑组织天冬氨酸和谷氨酸以及GABA浓度明显低于Fast组(均P<0.05)。

  

图1 各组大鼠颞叶皮质神经细胞突触的超微结构图。A：Sham组低血糖前；B：Sham组葡萄糖胰岛素混合液灌注后；C：Fast组葡萄糖再灌注后；D：Slow组葡萄糖再灌注后

应用 EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits（QIAGEN，德国）进行基因组甲基化修饰，并对修饰后的DNA进行反复洗脱、纯化，洗脱纯化的DNA放入-20℃保存。取质检合格的上述基因组DNA样本进行PCR扩增，并将PCR扩增产物回收。回收的PCR扩增产物送上海生工测序，并采用BiQ Analyzer分析软件对RANK基因组标准序列和测序序列进行比对。

  

表1 各组大鼠葡萄糖再灌注前、后氨基酸水平的比较(x±s，n=5，nmol/L)氨基酸水平Sham组Fast组Slow组低血糖前 谷氨酸1666±2041555±2581787±224 天冬氨酸371±27414±39422±29 丝氨酸12353±102314564±320713304±947 甘氨酸23649±213019687±305924524±3131 丙氨酸19722±171622401±366219937±2910 GABA205±68227±55238±61低血糖后A 谷氨酸5602±415∗5514±569∗5826±677∗ 天冬氨酸1602±338∗1482±452∗1590±428∗ 丝氨酸11913±747 13094±1969 12172±1064 甘氨酸20800±1564 19027±3755 21319±2426 丙氨酸15989±1254 21019±3912 15564±1951 GABA838±72∗746±89∗721±86∗葡萄糖再灌注后B 谷氨酸5824±401∗3502±456∗△○2158±357∗△○□ 天冬氨酸1720±364∗1085±289∗△○690±41∗△○□ 丝氨酸10920±652 11452±589 9891±512 甘氨酸19825±1720 20158±1825 19510±1475 丙氨酸14532±1200 15248±1125 16245±1057 GABA810±98∗522±74∗△○319±56∗△○□ 注：Sham组为葡萄糖胰岛素混合液同时灌注，A、B为实验中其他组对应的时间阶段；与低血糖后比较△P<005；与Sham组比较○P<005；与Fast组比较□P<005

  

图2 各组大鼠谷氨酸、天冬氨酸、GABA浓度的动态监测图

3 讨 论

为了提高船舶营运能效，航运界提出了多种节能减排的方法，例如降速航行、航线优化、气泡减阻、主机热经济学分析、采用LNG等新能源。但是，要采取这些节能减排的方法都要增加船舶的投资资本或者是降低营运效率，并且这些方法对不同的船舶有不同的适应性，因此不能进行普遍推广。本文利用FLUENT软件计算船舶不同吃水及不同速度时在单相流（水）、两相流（空气、水）中的阻力，并结合项目组研发的船舶能效监控系统实测出船舶在不同吃水差下主机每海里的油耗，比较船舶在同种工况不同吃水差下阻力和主机每海里油耗的变化趋势，从而找出在相应工况下的最佳吃水差。

1.2.3 神经细胞超微结构观察 按照随机数字表选取2只大鼠，取大脑颞叶皮质组织，在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中(4 ℃)修成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，并在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中(4 ℃)浸泡120 min；经漂洗(3次)、四氧化锇后固定、脱水、浸透、聚合、半薄切片定位、超薄切片等一系列步骤。经醋酸铀-柠檬酸铅染色后，在透视电镜下观察右侧颞叶皮质神经细胞超微结构变化。

低血糖在糖尿病患者中非常常见，尤其是在严格控制血糖的患者中，胰岛素治疗>15年的1型糖尿病患者低血糖的发生率为320次/100患者年[3]。低血糖大脑神经元损伤主要发生在大脑皮质、海马CA1区、齿状回、背侧纹状体。其中大脑皮质与高级智能活动密切相关，严重低血糖患者会出现认知功能障碍。故本课题组选择大脑皮质为取材部位。低血糖致神经元死亡并不是单纯的能量衰竭引起，而是由多个因素共同作用的，主要步骤包括谷氨酸受体激活、葡萄糖再灌注、活性氧簇(ROS)产生、Zn2+释放、线粒体通透性增加、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1) 激活[4-5]。其中氨基酸浓度的改变在神经元死亡的机制中具有重要作用。细胞超微结构是反应细胞损伤程度最直观的指标，电镜是观察细胞超微结构的最理想工具。神经细胞突触是神经元之间相互联系的重要结构，突触囊泡内存在氨基酸类神经递质。以上是本课题组实验设计的参考。关于供糖速度的研究设计，本研究参考了徐周伟等[2]的类似研究设计，同时尽可能排除血糖不同升高水平对实验结果的干扰，将低血糖后目标血糖水平控制在同一值范围内，以期探讨供糖速度对脑损害的影响。

本研究发现，造成低血糖时，模型大鼠大脑微透析液中的天冬氨酸、谷氨酸和GABA的水平均比低血糖之前显著升高，提示低血糖时可以带来脑组织产生生化改变。谷氨酸是广泛存在于CNS的兴奋性神经递质，主要产生于线粒体，能够造成低血糖神经细胞坏死[6]。谷氨酸大量释放，导致Ca2+大量内流，ATP耗尽，产生大量ROS和NO，线粒体通透性增加，细胞色素C和凋亡诱导因子大量释放，诱导细胞死亡[6]。低血糖时脑组织天冬氨酸聚集，天冬氨酸氨基转移反应方程式为：谷氨酸+草酰乙酸←→天冬氨酸+α-酮戊二酸[7]。天冬氨酸可以作用于某些谷氨酸受体亚型产生兴奋性毒性作用。

目前已经有研究[6,8]表明，大量的超氧化物、大量的PARP-1代谢产物，硝基酪氨酸，并不是产生在低血糖时，而是产生在葡萄糖再灌注的这一环节中，表明低血糖后葡萄糖再灌注对脑组织带来的损伤。前期的研究[2]发现，过快的速度升糖，会明显提高Bax/Bcl-2，进而促进细胞凋亡。关于低血糖后葡萄糖再灌注引起脑组织氨基酸变化的研究尚未见报道。本实验发现，葡萄糖再灌注后，脑组织谷氨酸和天冬氨酸以及GABA的水平显著下降，提示葡萄糖的直接供应可以显著的降低脑组织内产生的上述氨基酸的浓度。而以较慢速度的葡萄糖再灌注脑组织的天冬氨酸和谷氨酸以及GABA浓度降低尤著，提示较慢速度供应葡萄糖可以使兴奋性氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸的浓度降低，其对脑组织的兴奋性毒性作用降低，脑组织受到损害的严重程度降低。相反，低血糖时快速升高血糖可能不利于谷氨酸的降低，使神经元在遭受了天门冬氨酸的兴奋性毒性以后，又面临谷氨酸的损害。血糖升高越快，这种损害越严重。进一步经电镜观察可见，在葡萄糖再灌注后，Fast组突触前膜、突触后膜不清晰，多数有融合，突触间隙模糊不清。而在Slow组，突触前膜、突触后膜尚清晰，突触间隙大致正常，少数有融合，突触小泡增多不明显。提示快速再灌注葡萄糖脑组织的细胞超微结构损伤更明显，而较慢速度再灌注葡萄糖可以显著减轻细胞超微结构损伤。

与天冬氨酸和谷氨酸以及GABA的变化不同，在本研究中，葡萄糖再灌注后，实验大鼠脑组织的丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸有的出现了上升，有的出现了下降，但是均没有统计学意义，其可能的原因其一可能是实验操作造成误差；其二不同的代谢机制造成一些氨基酸水平升高，另一些氨基酸水平下降。

本次实验初步探讨了缓慢纠正低血糖大鼠的血糖水平有可能比快速纠正更有利于减轻低血糖大鼠的脑损害，这与临床治疗低血糖后一律快速的给予葡萄糖溶液的措施相矛盾。但是究竟什么样的速度最合适，可以使脑损害的程度降为最低，未来的研究中可以将慢速供糖组进行细化分类来探索最佳的速度截点。

[参 考 文 献]

[1] 余爱勇，邓星奇，赵玉武，等．糖尿病大鼠脑组织紧密连接蛋白Occludin表达的变化[J]．临床神经病学杂志，2011, 24：118.

[2] 徐周伟，赵玉武，刘建芝，等．升糖速度对低血糖大鼠脑损伤影响机制初探[J]．中华糖尿病杂志，2014，6：317.

[3] Kamenov ZA, Traykov LD. Diabetic autonomic neuropathy[J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 771: 176.

[4] 王喜云，赵玉武．低血糖脑损害机制的研究[J]．脑与神经疾病杂志，2014, 22：71.

[5] Suh SW, Hamby AM, Gum ET, et al. Sequential release of nitric oxide, Zinc, and superoxide in hypoglycemic neuronal death[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2008, 28: 1697.

[6] Suh SW, Gum ET, Hamby AM,et al.Hypoglycemic neuronal death is triggered by glucose reperfusion and activation of neuronal NADPH oxidase[J]. J Clin Invst, 2007, 117: 910.

[7] Duan Y, Gross RA, Sheu SS. Ca2+-dependent Generation of mitochondrial reactive Oxygen species serves as a signal for poly (ADP-ribose) polymerase-1 activation during glutamate excitotoxicity[J]. J Physiol, 2007, 585: 741.

[8] Suh SW, Aoyama K, Chen Y, et al. Hypoglycemic neuronal death and cognitive impairment are prevented by poly(ADP-Ribose)polymerase inhibitors administered after hypoglycemia[J]. J Neurosci, 2003, 23: 10681.