急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是青少年最常见的恶性肿瘤之一[1]。它来源于骨髓中淋巴样祖细胞的克隆增殖[2]。ALL占所有儿童急性白血病的80%左右，而成人患者只占20%左右。外周血各种血细胞减少是其最主要的临床表现[3]。探讨了解ALL的分子发病机制及发展进程是提高早期诊断和治疗效果的有效方式。

那么上述合理性的论证是否同样适用于那些被权利用尽区分适用理论所排除的产品呢？在这种区别适用理论中，“专门用于执行专利方法的产品”、“专门用于制造专利商品的零部件或设备”被排除出了权利用尽规则的范围。

MicroRNA（miRNA）是一类长度短小的非编码单链RNA分子，在多物种中发现其存在表达异常的情况，其在基因表达的转录调控中起重要作用[4]。近来研究数据表明，miRNA在不同恶性肿瘤的发展进程中扮演关键调控角色，包括急性白血病中miRNA与相关肿瘤抑制因子联合，调控部分蛋白和通路致癌活性[5]。有研究指出，miR-15a和miR-16在ALL细胞株中存在表达下调，2个基因都是在脆弱的结合位点出现突变，提示，部分miRNAs在白血病的发病机制起到关键性的调控作用[6]。有研究指出，miR-218在多种肿瘤细胞中表达水平均下调，且参与细胞生物学行为的调控[7]。但是miR-218在ALL中的表达水平和作用机制尚未有研究进行阐释。在本研究中，首先检测miR-218在ALL细胞株中的表达水平，然后根据生物信息学预测网站进一步确定miR-218下游的功能靶标，通过增殖和侵袭功能学实验检测miR-218通过调控SNX4对ALL细胞的生物学行为的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞株与主要试剂 ALL细胞株HuT78，BV173，K562均购自中国典型培养物保藏中心，E6-1和CCRFCEM购自上海细胞库。细胞培养条件：含10%胎牛血清的RPMI 1640，37 ℃，5% CO2条件下培养。胎牛血清、RPMI 1640培养基均购自美国Hyclone公司。Transwell小室购自美国Millipore公司，Matrigel购自美国BD公司。脂质体Lipofectamine 2000、NC模拟物和miR-218-mimic购自上海吉凯基因化学技术有限公司，TRIzol购自美国Ambion公司，逆转录试剂盒（FSQ-101）购自日本TOYOBO公司，PCR试剂盒购自美国Kapa公司。荧光素酶活性检测试剂盒（SNX4-Wt、SNX4-Mut）购自美国Promega公司。荧光素酶报告载体由美国Promega公司合成。实验分为NC组和miR-218-mimic组，转染miR-218-mimic慢病毒的E6-1细胞为miR-218-mimic组，转染阴性对照慢病毒的E6-1细胞为NC组。

杂乱的脚步声打破了寂静，几个警员赶来报告大好消息，四小姐来了。警员们早已看出，这个傲慢的白脸警官，只有在看到四小姐时，才会露出绵羊一般的性子。

2.2 双荧光素酶检测miR-218与SNX4蛋白之间的相互关系 通过使用Targetscan生物信息学数据库分析，将SNX4鉴定为潜在的miR-218靶标蛋白因子。结果显示，预测的高度保守的miR-218结合位点与SNX4的3'-UTR匹配（图2A）。通过双荧光素酶实验检测miR-218和SNX4之间的调控关系，结果显示，和突变型的SNX4的3'-UTR（MUT）荧光素酶表达质粒相比，野生型SNX4的3'-UTR（WT）荧光素酶表达质粒，荧光素酶活性升高（62.7%）。此外，miR-218模拟物在突变型SNX4的3'-UTR的细胞中没有诱导荧光素酶活性产生显着变化（图2B）。这些结果表明miR-218可以结合SNX4的3'-UTR，并显示SNX4是miR-218的直接靶标。

2.4 miR-218的表达对E6-1细胞株侵袭能力的影响 为了检测miR-218的表达水平对E6-1细胞侵袭行为的影响作用，本研究将miR-218-mimic转染到E6-1细胞中。结果显示，与NC组比较，过表达miR-218后E6-1细胞的转移细胞数目明显减少[（289.62±24.31）个vs（79.09±11.64）个]（P＜0.05）（图4）。表明增加miR-218的表达可以有效抑制E6-1细胞的侵袭能力。

2.1 miR-218在不同白血病细胞株中的表达水平 使用qPCR检测不同ALL中miR-218的表达情况。实验结果表明，在5种白血病细胞株（HuT78，BV173，K562，E6-1和CCRF-CEM）中观察到miR-218的表达在E6-1最低，未超过20%相对表达量，表明miR-218在E6-1白血病细胞株中可以扮演一定的抑癌作用，因此，本研究选择了E6-1细胞株进行后续研究（图1）。

1.5 Transwell侵袭实验检测miR-218对E6-1细胞侵袭能力的影响 所有试剂及器材均于冰上预冷，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶 50 μl（0.2 μg/μl），37 ℃孵育15 min，使胶凝固；消化2 min、1 200 r/min离心5 min、计数细胞后，按照2.5×104个/ml用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液；按照每孔200 μl，将细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基500 μl，放入37 ℃孵箱培养；甲醛固定，结晶紫染色15 min，然后用棉签轻轻擦拭内膜上的细胞。显微镜下计数4个高倍视野（×400）下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

技术人员在测量低静压、低流速、大口径的湿气体流量以及气态氨之类的流体流量时，通常选用标准差压流量计。但使用一段时间后，经常发现冷凝液在节流件前和三阀组通道内聚积、在差压变送器高低压室内聚积，引起流量计严重失准。针对这一问题，上海同欣自动化仪表有限公司开发了FDIh湿气体流量计，主要作了三点改进：

2.3 miR-218的表达对E6-1细胞株增殖能力的影响 为了检测miR-218的表达水平对E6-1细胞增殖行为的影响作用，本研究将miR-218-mimic转染到E6-1细胞中。结果显示，miR-218-mimic组增加miR-218的表达水平后，与NC组比较，E6-1细胞在72 h和96 h时细胞增殖比率分别减少35%和48%，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。表明增加miR-218的表达可以有效抑制E6-1细胞的增殖能力。

2 结果

1.4 Transwell侵袭实验检测miR-218对E6-1细胞增殖能力的影响 细胞增殖实验使用CCK-8试剂盒测定。将NC组和miR-218-mimic组的E6-1细胞接种分别接种在96孔板中，每孔1×103个，孵育72 h。孵育过后，用PBS冲洗细胞2次。向每个孔中加入新鲜培养基（200 μl），然后加入20 μl的CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育4 h。使用酶标仪板在490 nm波长下测量不同组的OD值，根据2组OD值计算细胞相对增殖比率。实验重复3次。

1.6 统计学处理 应用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，计量资料以 ±s表示，计数资料以率（%）表示，2组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

  

图1 miR-218在不同急性淋巴细胞白血病细胞株中的表达水平

1.2 qPCR检测miR-218的表达水平 按照TRIzol说明书提取组织中总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度，广州复能基因有限公司设计miR-218引物，miR-218-上游引物：5'-CGCCGCCTGTGCGTGAGGAT-3'；下游引物：5'-GCCTAGTTTGACGAGAGGT-3'。以100 ng总RNA为模版，逆转录cDNA，反应条件为：37 ℃15 min，98 ℃ 5 min。后根据PCR试剂盒说明书进行PCR反应。获得数据以相对定量值RQ=2－ΔΔCT计算mRNA表达量。实验重复3次。

  

图2 双荧光素酶检测miR-218与SNX4蛋白之间的相互关系

 

注：A：miR-218和SNX4之间的结合位点；B：双荧光素酶实验检测miR-218和SNX4之间的相互调控关系

在现有电机试验站中，电机进行型式试验需要使用的变频变压电源，其在输出频率电压调节、电源供电质量以及一些特殊应用上都有较高的要求，系统比较复杂，造价占比也较高。对于大功率试验站的变频变压试验电源，目前可供采用的产品和方案大致可以分为静止变频电源与机组变频电源两大类。

1.2.5 邀请行业专家指导 训练过程邀请行业专家予以指导。一方面，口腔修复人员牙齿排得好不好，或者牙雕得是否漂亮，由资深的口腔工艺行业专家给予评定更具有权威性，虽然他们不是评委，但能根据实践经验与学识给出具有建设性的意见。选手根据他们给出的意见不断改进，会取得意想不到的效果。另一方面，选手也希望通过这种方式激励自己。因为这些专家都在口腔工艺专业领域有所建树，能有机会与这些专家近距离探讨问题，选手倍感自豪，从而增强了自信心。

  

图3 细胞增殖实验检测miR-218对E6-1细胞株增殖能力的影响

 

注：与NC组比较，aP＜0.05

1.3 双荧光素酶实验 为明确miR-218能否与SNX4 3'UTR结合，本研究将miR-218-mimic与SNX4-Wt、SNX4-Mut共转染到293 U细胞中。将荧光素酶报告载体与miR-218-mimic共转染293 U细胞。以转染pRLTK作为标准体。转染36 h后，收获细胞。按荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测293 U细胞荧光素酶活性。计算公式：荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。实验重复3次。

  

图4 细胞侵袭实验检测miR-218对E6-1细胞株侵袭能力的影响

 

注：与NC组比较，aP＜0.05

3 讨论

随着近年来关于白血病的研究不断进展，ALL的遗传特征和分子机制变得越来越清楚，但ALL的中位生存期仍为12～18个月左右[8]。肿瘤细胞的快速增殖和远处侵袭转移是大多数恶性肿瘤进展的标志，包括血液系统肿瘤[9]。所以，为了寻找急性淋巴细胞性白血病的新的诊断指标和临床靶点治疗方向，改善其临床治疗结局，研究miRNA在ALL的相关作用是重要的实验手段。

许多研究表明，细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡受蛋白质编码癌基因或肿瘤抑制基因的影响[10]。最近，越来越多的证据也表明，小非编码RNA（如miRNA）可以通过负调控癌基因或肿瘤抑制基因的表达干扰下游蛋白或信号通路的激活，进而参与到肿瘤细胞的行为调控中去[11]。例如，miR-15和miR-16已被证明可以通过靶向慢性淋巴细胞性白血病中的BCL2诱导细胞凋亡，进而抑制慢性淋巴细胞白血病的发展进程[12]。miR-218是一种抗增殖因子，在胃癌、结肠癌等已被证明有抑制肿瘤细胞增殖，间接促进肿瘤细胞凋亡的作用。而金爱琴等[13]报道指出miR-218可以抑制CCRF-CEM急淋细胞的增殖活性。表明miR-218在淋巴细胞白血病的具有一定的调控作用。

排序连接蛋白（sorting nexins，SNXs）是一类含有PX结构域的蛋白，在细胞内吞和蛋白分选运输等细胞过程中发挥重要作用[14]。PX结构域可以特异性与磷脂酰肌醇结合，介导SNXs靶向作用特异磷脂酰肌醇的细胞器。在SNXs蛋白中，SNX-PX-BAR的功能研究较多，被认为在体内的分选运输中发挥关键的调节作用。SNX9、SNX18和SNX33除了含有PX结构域和BAR结构域，还有SH3结构域，它们在网格蛋白介导的细胞胞吞作用中发挥作用[15]。SNX9和SNX18 的表达沉默会抑制转铁蛋白受体的吸收[16]。所以SNX家族蛋白在细胞的基础生物学行为的过程中起到多样的调控功能。而本研究着重研究SNX4蛋白，是一类细胞能量调控蛋白，一般参与调节转铁蛋白受体 由胞内向质膜循环转运的过程[17]。干扰细胞能力的供应，可以间接影响细胞增殖和侵袭行为的进展，从而达到抑制肿瘤细胞恶性生物学行为的作用。目前，SNX家族的研究才刚刚起步。揭示SNX4的功能及其机制，还需要更多的细胞生物学和结构生物学的研究支持，为SNX4在细胞中的角色定位提供更多的实验支持。

在本研究中，观察到在ALL细胞株中，miR-218的表达水平存在明显的下调。这与以前在胃癌和结肠癌中的研究报告结果相一致，表明miR-218在ALL中可能表现为一定的抑癌作用，在肿瘤细胞中表现为低表达[18]。本研究首先通过生物信息学网站预测miR-218和下游SNX4的相关关系，证实miR-218可以干扰SNX4的表达活性，进而通过细胞增殖实验和Transwell侵袭实验证实miR-218对ALL细胞株增殖能力和侵袭能力的干扰作用。本研究进一步明确了miR-218是通过作用于SNX4直接功能靶标对ALL进行干扰调控，而不同miRNA的不同靶标可能介导不同的生物学功能，后续实验拟继续验证是否有其他相关作用靶点在其白血病发生发展过程中发挥作用。

综上所述，本研究通过实验证实miR-218通过调节SNX4的表达活性调控ALL细胞株的增殖和侵袭等生物学行为。这些结果丰富了miR-218和SNX4在急性淋巴细胞白血病癌变中的作用机制。为研发miR-218作为ALL患者的生物诊断标志物或作为miRNA替代治疗候选物提供了一定的理论参考意见。

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