恒温扩增芯片法是基于环引物介导恒温扩增技术(LAMP)，对下呼吸道病原菌进行快速诊断的方法。LAMP法利用特定引物在等温条件下进行链置换反应，从而进行核酸扩增的一种技术，该技术已经广泛应用于细菌、病毒、真菌等一系列病原微生物检测[1-2]。对于呼吸系统疾病来说，该技术丰富了呼吸道感染的病原学诊断手段，对指导使用抗生素治疗有很大的帮助[3]。恒温扩增方法全程保持在65℃左右，无需高温变性，低温退火过程，扩增速度快过普通PCR技术，能够在1～2 h内对病原菌进行检测[4-5]，与传统痰培养相比，具有阳性率高、快速及敏感等优点，特别对于培养周期长及难以培养的病菌进行快速诊断，对指导临床治疗具有较高价值[6]。本鉴定方法在芯片中集成13种病菌的引物，与其它病菌无交叉反应，不包含病毒、真菌基因及人类基因检测。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择我院2016年5月至2017年10月期间在我院重症监护病房使用机械通气治疗的56例新生儿作为研究对象，其中男婴32例，女婴24例，胎龄28～40周，平均住院时间(15.0±2.65) d。痰标本采集时间均在使用抗生素治疗前、机械通气后48 h进行，平均采痰时间(3.04±1.33) d。所有病例均排除住院48 h内死亡病例、社区感染肺炎、遗传代谢病、严重先天性心血管疾病以及宫内感染性肺炎。

1.2 方法

1.2.1 痰液提取方法 采用经气管内吸痰取深部痰液的办法，在机械通气48 h后，暂未使用抗生素治疗时进行。用无菌生理盐水3 mL冲洗气道后，用带储痰器的无菌吸痰管吸取痰液，用无菌防漏容器分装2管于2 h内送检。

1.2.2 痰液样本检测方法 将痰标本移到能密封的无菌容器内，向标本加入等体积的10% NaOH，37 ℃液化30 min，取1 mL液化液离心后弃上清液，加入洗涤液洗涤，加入核酸提取液提取DNA备用。痰液DNA制备后在芯片加样，移入博奥公司生产的RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪进行检测，扩增反应条件设为37 ℃预热3 min，65 ℃47 min扩增[7-8]。普通痰培养接种血平板，中国蓝平板，36℃孵育，优势菌定为致病菌，法国梅里埃全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

1.2.3 检测结果判断 LAMP检测系统针对13种下呼吸道常见病原菌进行靶基因扩增检测，包括肺炎链球菌(SPN)、金黄色葡萄球菌(SAU)、耐甲氧西林葡萄球菌(MECA)、大肠埃希氏菌(ECO)、肺炎克雷伯菌(KPN)、铜绿假单胞菌(PAE)、鲍曼不动杆菌(ABA)、嗜麦芽窄食单胞菌(PMA)、流感嗜血杆菌(HIN)、嗜肺军团菌(LEN)、肺炎支原体(MPN)、肺炎衣原体(CPN)、结核分枝杆菌(MTB)。检测值以出峰时间(TP)作为阈值判断，产物扩增曲线呈S型，在进入快速扩增第一个拐点对应的时间与原点时间差值定义为TP值。当检测指标的TP值小于该指标的阳性判断值时判断为阳性。反应板内设有1个阳性内参，9个阴性质控及1个人基因组DNA。阳性内参表示最低检测限为5×102拷贝/反应，检测结果为阳性表示样品中含有高于最低检测限的该细菌核酸，阴性内参及人NDA以质控实验环境和人为操作。

由于LAMP技术针对特定病菌的靶基因位点合成特异性的引物进行DNA扩增，即使少量病菌存在也能测定，特别在上呼吸机早期24～72 h之间痰培养技术很难发现的微量病菌，也能通过LAMP法进行鉴定。通过LAMP法与痰培养方法的比较，了解上呼吸机患儿早期气道内病菌的生长规律，明确LAMP法的使用价值。本研究方案为了避免抗生素对结果的影响，选择暂未使用抗生素的上机患儿病例，在机械通气早期进行吸痰检测，标本采集平均时间3 d左右。结果，LAMP法测定的下呼吸道病菌阳性率为46.43%，对比痰培养阳性率，其敏感性明显提高。在临床观察中也发现，LAMP技术在1 d内有结果，而痰培养至少经过3 d后才能判断可疑结果，5 d后进行药敏及细菌鉴定。这充分说明LAMP法技术在快速检测，敏感性高方面的优势。

1.3 统计学处理

痰液样本LAMP法阳性率46.43%，对比痰培养法阳性率26.79%敏感性明显提高(χ2=4.655，P＜0.05)。总体阳性符合率用Kappa一致性检验分析，Kappa＞0.4，表明LAMP法与痰培养法阳性符合率一致。分别比较各菌种阳性符合率一致性，耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌kappa＞0.4，阳性符合率一致；肺炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、阴勾杆菌、铜绿假单胞菌kappa＜0.4，无一致性。见表2、3。

观察组检出附件包块15例,原始血管搏动4例,盆腔积液10例,总共内假孕囊1例;对照组检出附件包块20例,原始血管搏动9例,盆腔积液15例,子宫内假孕囊16例;观察组显著优于对照组,P<0.05,差异有统计学意义,见表1。

2 结果

2.1 LAMP法检测菌株分布

离散Chirp-Fourier变换是一种有效的Chirp信号检测方法，参数匹配不存在交叉项，但有两个约束条件：信号长度必须为质数；离散Chirp信号参数必须为整数。针对该限制，文献[6]提出一种修正离散Chirp-Fourier变换，其定义为

 

表1 机械通气患儿下呼吸道痰标本LAMP法菌株构成比

  

SPN SAU MECA 1 3 1 1 3.85 11.54 42.31 ECO KPN PAE ABA PMA 4 2 2 2 1 15.38 7.69 7.69 7.69 3.85

  

图1 LAMP法单菌株与混合菌株构成比

2.2 痰培养法检测菌株分布

LAMP法特异性强，敏感性高，能早期发现细菌繁殖情况，为早期干预性治疗带来很大的帮助。痰培养阳性率偏低，除了技术方面因素外，可能与上机早期病菌繁殖率偏低有关。此外，痰培养方法耗时长，不能及时提供检查报告，为早期指导抗生素治疗带来困惑。临床上，感染指标如PCT、CRP、胸片等变化能够提示感染迹象，但最好能有客观的病菌检测报告来指导使用抗生素。有关资料表明，机械通气的患儿上机时间达2周后，出现呼吸机相关性肺炎风险明显增加，非感染平均时间6 d左右。Meta分析，呼吸机相关性肺炎与早产儿，呼吸机上机时间超过3 d等因素相关性大[10-11]。因此，对这类上机患儿的呼吸道感染情况调查，明确气道内病菌的分布规律及繁殖状况是重症监护病房控制感染流行的重要环节，并且需要更多有效的方法进行监控，而LAMP技术的应用能够提供很大的帮助。

2.3 痰培养法与LAMP法阳性率及阳性符合率一致性比较

痰培养与LAMP法敏感性比较采用配对χ2检验及结合Kappa一致性检验分析，菌株分布采用列表方法表示，混合菌分布使用图表法表示，数据资料用SPSS13.0软件进行分析。Kappa＞0.4表示一致较好，Kappa＜0.4表示无一致性。

56例下呼吸道痰液标本LAMP法检测发现菌株26例，阳性率为46.43%，包含8种病原菌株，菌种分布G+性菌株57.69%(15例)，G-性菌株43.31%(11例)，未检出结核分枝杆菌，肺炎支原体，肺炎衣原体，嗜肺军团菌及流感嗜血杆菌，见表1。检测结果包含单菌株及混合菌株，其中单菌株11例，2种菌株2例，3种菌株2例，5种菌株1例，见图1。

3 讨论

 

表2 痰培养法与LAMP法阳性率及阳性符合率一致性比较

  

阳性阴性合计13 2 15 13 28 41 26 30 56

新生儿机械通气治疗过程中容易出现下呼吸道细菌感染，加上免疫系统发育不成熟，抗体水平低下，特别是超未成熟儿未能从母体获得足够免疫球蛋白，很容易引起呼吸机相关性肺炎[9]。因此，加强气道管理及病原菌监测是防治呼吸机相关性肺炎的重点。传统上，患儿在治疗过程中出现肺部感染情况下取痰细菌培养是鉴定病原菌的金标准，但这种方法有很大的局限性：痰标本合格率低，培养阳性率低，培养周期长。普通细菌培养一般需要48～72 h，不能快速指导抗菌药物使用，部分病菌培养困难，例如流感嗜血杆菌需要含有NAD及铁的培养基。支原体感染检测条件更加苛刻，培养阳性率低，耗时较长且需要一定的实验室条件，所以有必要采用更加快捷、敏感的方法进行检测，而LAMP技术能够弥补痰培养方法的不足。

 

表3 各病原菌LAMP法及痰培养法检测一致性比较

  

MECA 7 4 ECO 3 1 SPN 0 1 SAU 1 2 ABA 1 1 KPN 1 1 PAE 0 2 EC 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 28 28 28 28 28 28 28 28 0.658 0.840 0 0.475 0.650 0.650 0-0.034

我国大量体育设施集中在教育系统，而高校场馆设施是其中的重要组成部分，较之于其他系统场馆有着明显的优势。通常高校场馆建筑体量大、建设投入高，社会力量难以单独完成投资建设，而高校场馆有国家和学校作为后盾依靠，在资金保障方面具有一定优势。在实际运营过程当中，借助高校事业单位性质，水电气热等能源费用可按照行政事业标准缴纳，有利于降低运营成本，节约大笔费用支出，另外在申报承办各类运动会项目时，高校的良好社会效应也是赛事举办方综合考量的因素之一。在人才培养方面，也可结合本校体育院系(学部)优势直接培养优秀人才。综合来看，高校场馆在各项运营条件方面具备一定优势[8]。

56例下呼吸道痰液标本培养检出菌株均为优势菌株，排除了混合菌株，痰液标本阳性率为26.79%(15例)，包含6种菌株，G+菌株60%(9例)，G-菌株40%(6例)，其 中 MECA 53.33%(8例)，ECO 20%(3例)，阴勾杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌各1例。

本研究结果显示，LAMP法及痰培养法总体阳性符合率呈一致性，说明两种方法对下呼吸道病菌检测结果均可靠，也说明LAMP法的依从性较好。分别比较各病原菌的阳性符合率发现，耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌阳性符合率一致，其它病菌阳性符合率低，原因可能与个别菌种痰培养阳性率偏低有关，但LAMP法作为新技术应用在临床诊断方面达到了预期效果。研究中发现，与痰培养比较，LAMP法更容易检测到混合菌株，如图1所示，这可能与以下几方面有关：标体中的确混有污染菌，或在病菌生长过程出现多种定植菌。普通痰培养能够避免这种情况出现，因为培养过程中可以挑选出优势菌种进行鉴定，如果发现标本杂菌较多，考虑标本不合格而弃用，但基因方法不能挑选优势菌株。另外，机械通气患儿气道与外界相通，出现多种污染菌的机会本身就大。但总的来说，单菌种检测结果仍占多数(68.75%)，至于出现混合感染菌，可以通过PCR定量方法进行鉴别。

2．胰酶制剂：我国目前使用的胰酶制剂有胰酶肠溶胶囊(得每通)、米曲菌胰酶片(慷彼申)等。临床常用的得每通所含胰酶含量最高，其pH敏感肠溶包衣可以使胰酶在十二指肠处快速释放，超微微粒剂型有利于胰酶与食糜充分混合，促使营养物质吸收。慷彼申除含有高活性胰酶外，还含有米曲菌酶，在胃肠道均发挥作用。

混合菌是否感染或定植较难辨别，有报道称可通过检测病菌靶基因DNA拷贝数来区分感染和定植的上下界值，如对特定的细菌靶基因，界值定为＞104/mL考虑与临床感染相关[12]。但不同的病菌靶基因不同，其界值不同，通常上界值在104～108/mL，下界值在104～106/mL，数量级不等。测定结果高于上界值考虑为感染菌，低于下界值考虑为定植菌[13]。但LAMP法与普通PCR 鉴定方法不同，用各病菌出峰时间(TP值)进行比较，低于TP值考虑为感染菌。不同的菌种TP值是不同的，结合芯片内集成的阴性及阳性对照组参考，可排除假阳性及假阴性的情况，增加检测的敏感性及特异度。当患儿呼吸道出现细菌感染，气道内分泌物会增多，痰液以黄脓痰为主，胸片显示肺部纹理增粗，阴影加深，血清PCT、CRP及WBC相应增高[14]，或出现血小板减少，通过这些变化来区分感染或定植。

尽管LAMP法检测灵敏，特异性强，但也存在着以下几点不足：(1)不能查药物敏感性，因为LAMP检测的是病菌核酸，与药物敏感试验方法明显不同；(2)LAMP法对耐药菌种的检测范围未完善，只能检测葡萄球菌的耐药性，对其它病菌的耐药性检测非常欠缺；(3)在研究过程中发现有混合感染病菌，不能筛选出优势菌进行鉴定；(4)对阴性杆菌检测不够全面，也可能导致本次研究结果G+球菌占优的原因之一； (5)在检测过程也发现，由于基因检测的局限性，痰培养可能检测的病菌不在基因检测范围内，如阴勾杆菌，粪肠球菌等。此外真菌及病毒检测方法也欠缺。但总的来说，目前尚无完美的病原学诊断手段，传统痰培养或LAMP法都存在某方面的缺点。LAMP 作为一种新型的检测方法丰富了诊断手段。通过本研究，找出LAMP法中不足的地方，加以完善才是目前基因诊疗的研究重点，如继续加强对病菌特定靶基因的研究，明确抗生素对病菌耐药基因变异的影响，经过逐步深入研究，使LAMP技术在不久的将来能完全代替痰培养在临床上推广应用。

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