一、引言

枣原产于我国，是我国特有果树资源，在区域经济发展中占有举足轻重的地位。多年来，我国枣树育苗一直使用传统的无性繁殖方法，育苗速度慢，繁殖率不高，无法去除幼苗体内的病毒。而枣的组织培养再生体系的建立既可以大量的繁殖苗木，又可进行无病毒苗木培养，还可以进行种质资源的离体保存，为现代生物技术育种奠定了基础。

枣树的组织培养起步相对较晚，相关研究始于20世纪70年代末。1978年，山东农学院首次利用枣胚乳培养获得3倍体植株［1］，之后陈维伦等利用组织培养方法诱导酸枣产生胚状体［2］。1983年，张福泉等以坛坛枣当年生幼嫩茎段为试材获得枣树组培苗［3］。目前，已有20多个品种以不同类型的外植体建立了无菌离体繁殖体系。枣营养器官的培养一般以茎尖、茎段、芽以及叶片作为外植体。外植体的取材部位、大小、时间等直接影响组培快繁体系的建立，选择合适的外植体是组织培养成功的重要保证。枣属于木本植物，有幼年型和成年型之分［4］，幼年型组织较容易培养。枣组织培养外植体部位很关键，在枣茎尖、茎段培养中，一般选用幼嫩的枣头［3］，也有来自根蘖和休眠枝的水培芽［5-6］和休眠芽［7］作为外植体培养成功的报道。罗晓芳［8］等以金丝小枣为试材得出以根蘖条水培抽出的嫩芽效果最好，且污染率低，存活率高，生长分化状况也最好。对于水培用枝条的采集时间的选择，以枝条通过自然休眠为宜，一般11月底至次年萌芽前采集［8-10］。不同枣品种取材时间不尽相同，但均以生长旺盛易启动、不易污染为原则。为此，本研究以冬枣、赞皇大枣和酸枣为试材，通过外植体采集、灭菌和培养基的筛选，旨在建立这几个品种和类型的无菌体系。

二、研究方法

（一）取材方法

室内取材，以冬枣和酸枣的休眠枝经过水培而萌发的枣头为试材，取材的枣头为生长到10cm左右的一年生枝，将其剪切为1～2cm的带芽茎段作为外植体，接种到MS培养基。

珠三角、长三角、京津冀作为中国区域经济一体化的三大重点经济圈均受到了不同程度的政策倾斜与支持，改革开放之后，随着上世纪70年代深圳经济特区和90年代上海浦东新区的建立，珠三角与长三角的对外贸易和区域经济发展都得到了不同程度的推动。京津冀地区身处内陆，缺乏长三角和珠三角的对外贸易地理优势。同时相较于北京天津高水平的科技实力和对人才的强劲吸引力，河北省在基础设施建设、高新技术水平提升和产业结构优化等多个领域都与京津地区有较大差距。因而，要推进区域经济的协调发展，推动京津冀地区一体化水平的提升，需要通过新区的建设来增强河北省经济发展和产业结构调整的动力，从而提升京津冀协调发展水平[2]。

室外取材，品种为冬枣、赞皇大枣和酸枣，选标本园中生长健壮的枣树刚萌发的枣头作为试材，长度大约为10cm左右的一年生枝，然后将其剪切为1～2cm的带芽茎段接种到MS培养基。

试材为3个品种和类型，分别为冬枣、酸枣、赞皇大枣。基本培养基为MS培养基，在接种的培养基中加入不同浓度6-BA和IBA，即MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L），MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L），MS+6-BA（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L），分别将这3个不同的品种或类型接种到3个处理的培养基中。

（二）采集时间与接种

来自不同环境的外植体，在接种20天后统计接种外植体的污染率。结果显示，采自酸枣水培苗的平均污染率为12.5%，而采自田间的平均污染率为43.8%；采自冬枣水培苗的平均污染率为14%，而来自于田间的外植体平均污染率为32%。结果表明，对于相同物候期采集的外植体来说，水培苗的污染率低于田间苗。因此，在有条件的情况下，采集休眠枝在适宜条件下通过水培萌发的枣头，作为外植体进行接种效果更好。

13号和14号的污染率相差大，这与采集当天的天气状况有关。14号阴天且天气潮湿，易染菌，带菌率比较高。因此，采集外植体应在晴天中午进行。另外，早晨有露水，也不适于采集。图中显示，同一时期采集的酸枣和其他两个枣品种污染率相差大。据观察可知，酸枣的物候期早，因而萌芽早，需提早采集。

接种之前进行灭菌处理，采集的外植体先剪成2～3cm的茎段，放入烧杯中用自来水冲洗30～60min，以除去尘土和杂质，然后用0.1%的HgCl2杀菌5～10min，最后用无菌水冲洗3次以上。对采集的冬枣和赞皇大枣根据不同的灭菌时间处理，分别接种到通用的MS培养基。

（三）培养基和激素浓度

碳关税模块包括两个部分:一是通过碳排放因子对相应的碳排放系数进行计算，二是通过对出口商品含碳量进行碳关税的征收。具体碳排放系数计算如式(5)所示:

图2显示，随着灭菌时间的延长，成活率逐渐增加，由于设置时间不多，灭菌效果仍未达到最佳，可适当延长灭菌时间。

三、结果与分析

（一）采集条件对外植体染菌率的影响

试材品种为冬枣、赞皇大枣和酸枣，田间正常生长的枣头，从刚萌芽开始，分别采集于5月7号，5月10号，5月13号，5月14号，5月18号，5月20号，按采集时间的不同分别接种。

（二）采集时间和灭菌时间对外植体污染率的影响

结果显示，采集时间和灭菌时间的不同对外植体的污染率影响非常大。从图1可以看出，无论是冬枣、酸枣还是赞皇大枣，随着采集时间的延后，污染率呈上升趋势，5月14号以后采集的外植体污染率接近100%。此结果说明，枣头生长到一定阶段就不适合作为外植体进行接种，因为时间越延后，感染病菌的机会越大。另一方面，枣树枝条逐渐木质化，也不利于接种。表中18号和20号的污染率反而下降，是因为统计污染率最后时间是6月4号，而菌类的生长期为5～20天。

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在实验记录中，接种外植体后枣芽萌发的都记录为出芽率，而枣芽萌发以后长出的嫩茎在1cm以上都记录为成株率。

第四，应对挑战，规避“短板”。建设具有国际影响力的医疗旅游目的地，不是一蹴而就的事情，要统筹规划、分步推进。在发展初期，应以收缩、合并为主要策略，规避短板，集中优势资源，打造“品牌效应”，积极推进中医药健康养生旅游产品建设是重要抓手；随着优质医疗资源的引进，适时推出医疗服务品牌产品。

  

图1 不同品种取材时间对污染率的影响

  

图2 灭菌时间对冬枣和赞皇大枣成活率的影响

（三）不同浓度的植物生长调节剂和配比对分化的影响

植物生长调节物质在启动培养基中起着关键作用，主要表现在种类、浓度和植物生长调节剂之间的配比等方面，枣组织培养需要生长素和细胞分裂素，而当细胞分裂素/生长素的比值低时，诱导根的分化；两者比值处于中间水平时，愈伤组织只生长不分化；两者比值较高时，诱导芽的形成。在试验中加入不同浓度的6-BA和IBA，比值为5和10，在3种不同植物生长调节剂浓度和配比的培养基中分别接入冬枣、酸枣、赞皇大枣，结果见表1、表2和表3。

 

表1 不同激素浓度和配比对酸枣分化的影响

  

培养基MS+6-BA（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L）接种数72 76 84平均出芽率83%89%52%平均成株率50%66%18%

 

表2 不同激素浓度和配比对冬枣分化的影响

  

培养基MS+6-BA（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L）接种数128 132 112平均出芽率90%73%57%平均成株率53%36%13%

 

表3 不同激素浓度和配比对赞皇大枣分化的影响

  

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由上面3个表得知，酸枣最适的培养基为MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L），冬枣最适的培养基为MS+6-BA（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L），赞皇大枣最适的培养基为MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L）。因此，不同的品种需要不同浓度的植物生长调节剂和不同的配比。下图可直接看出不同的培养基接种不同品种的长势。

  

图3 5月7号采集的酸枣在MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）培养基的生长状况

  

图4 5月7号采集的酸枣在MS+6-BA（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）培养基的生长状况

  

图5 5月10号采集的酸枣在MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）培养基的生长状况

  

图6 5月7号采集的冬枣在MS+6-BA（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）培养基的生长状况

  

图7 5月7号采集的冬枣在MS+6-BA（1.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）培养基的生长状况

  

图8 5月10号采集的赞皇大枣在MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L）培养基的生长状况

  

图9 5月7号采集的赞皇大枣在MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L）培养基的生长状况

  

图10 5月10号采集的赞皇大枣在MS+6-BA（0.5mg/L）+IBA（0.1mg/L）培养基的生长状况

四、讨论

试验研究了外植体的取材时间、灭菌时间、植物生长调节剂的浓度对接种及出芽的影响，且建立了冬枣、赞皇大枣和酸枣的无菌再生体系。在以后的试验中还应继续建立继代培养、生根培养和组培苗移栽的完整体系，进一步完善组培苗无菌体系的应用。枣树组织培养研究起步晚，而且集中于茎尖和茎段的培养，目的主要是建立快繁体系，而利用离体叶片建立枣的再生体系尚且不多，需要通过研究影响叶片离体再生的主要因素。

参考文献：

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