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汉族新生儿呼吸窘迫综合征ABCA3基因多态性频率分布

更新时间:2009-03-28

新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)即肺透明膜病(hyaline membrane disease,HMD),作为新生儿重症监护室(NICU)较常见的危重症之一,既是导致早产儿死亡最主要的疾病,也是致后期支气管肺发育不良的主要病因[1,2]。在美国,NRDS是导致<1岁婴儿死亡率最高的呼吸系统疾病[3]。其发病机制复杂,涉及胎龄、性别、地域民族分布差异、不同分娩方式等多个因素,胎龄越小,发生NRDS的可能性越大,而胎龄大的新生儿发生NRDS有可能为难治性NRDS。既往认为肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)缺乏或分泌不足是导致NRDS发生的关键因素,而随着研究的深入,发现遗传性因素也可通过改变PS的结构或功能,引起PS的代谢循环障碍,导致NRDS发生。PS构成的主要成分是脂类,其次是肺表面活性蛋白(surfactant protein,SP),后者占总含量的8%~10%。SP虽然含量少,但具有降低肺泡表面张力、抗感染、免疫调节等作用,对于维持肺泡正常功能有重要作用,目前国内外大量研究已证实,SP-B、SP-C缺乏与NRDS发病密切相关,其中几个基因多态性位点可能会增加NRDS发病的危险性,少数的突变位点甚至可导致难治性NRDS发生[4]。ATP结合盒转运子A3(ATP-binding cassette transporters A3,ABCA3)主要负责将脂质转运至板层小体,并在板层小体内完成表面活性物质的组装、加工和存储过程,对PS的代谢发挥独特作用。ABCA3突变可导致ABCA3蛋白折叠、包装和分泌异常,蛋白表达减少或损伤,磷脂转运障碍,也可继发性影响SP-B、SP-C的合成和分泌过程[5]。相关研究表明,ABCA3缺乏不仅可导致NRDS发生,而且与儿童或青少年时期肺间质性疾病(interstitial lung disease,ILD)相关[6-8]ABCA3 基因组较为庞杂,相对于SP-BSP-C基因位点而言,其变异位点相对较多,大多变异是罕见的。目前报道大约有超过180种ABCA3基因变异位点,其中ABCA3基因第10外显子区域基因突变与基因多态性研究是热点[9]。本研究利用临床病例和生物基础研究相结合的思路寻找ABCA3 外显子10(ABCA3 exon10)有无基因突变或基因多态性位点存在,以及对基因突变或多态性位点进行对照研究,以期探寻内蒙古自治区NRDS发病的分子遗传学机制及防治的新策略。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2014年9月至2016年9月于内蒙古医科大学附属医院NICU住院治疗的汉族NRDS新生儿53例为病例组,研究对象纳入标准:①出生24小时内;②直系三代亲属均为居住在内蒙古西部地区的汉族;③符合NRDS诊断标准[10]。以同期NICU住院的同性别、同胎龄、汉族非NRDS新生儿53例为对照组,纳入标准:①出生24小时内;②直系三代亲属均为居住在内蒙古西部地区的汉族;③胸片提示无明确肺部感染和NRDS表现,血常规和超敏C反应蛋白检查显示无明确感染者。病例组及对照组均排除以下情况:①先天性疾病或遗传代谢性疾病;②孕母患有糖尿病;③实验室检查提示严重感染;④有明确宫内或生后窒息缺氧史;⑤其他可能伴有呼吸症状的疾病,如胸壁畸形等。本研究获得医院伦理委员会批准。家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理 分组收集并整理样本,进行基本资料信息匹配,留取病例组及对照组静脉血500 µL,EDTA-K2抗凝,置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 样本基因组DNA提取 在500 µL静脉血加入细胞裂解液600μL,充分混匀;反复离心,离心力7 104×g,离心5min,弃上清,用500 µL TE Buffer重悬沉淀,直至沉淀为白色;加入180 µL细胞裂解液和20 µL蛋白酶 K溶液震荡混匀;置56 ℃水浴15~30 min至细胞完全裂解,并加入60 µL Buffer PR,充分颠倒混匀后-20 ℃冰箱中放置5 min;再次室温下离心力10 000×g离心5 min,留取上清,并转移至新的1.5 mL离心管中,加入等体积异丙醇,充分颠倒混匀,室温放置2~3 min后,离心力10 000×g离心5 min,弃上清;再加入1 mL 75%乙醇,颠倒漂洗1~3 min,离心力10 000×g离心2 min,弃上清,并重复该步骤1次,最后开盖室温下倒置5~10 min,使残留的乙醇完全挥发后剩余即为所提取的DNA;将所得到的DNA用50 µL TE Buffer溶解,即提取DNA成功。对所提取的DNA进行浓度和纯度测定,DNA浓度用ng/µL表示,>25 ng/µL说明所提取DNA浓度较高;DNA吸光光度测定(OD260/280)范围在1.7~1.9时证明DNA浓度较纯。

能源消费增长的同时,能源转型持续推进。前三季度,水电、核电、风电、太阳能发电等清洁能源发电装机合计占总装机的36.4%,比去年同期提高1.4个百分点;清洁能源发电量同比增长8.9%,高于火电增速2.0个百分点。

1.2.3 PCR扩增 委托生工生物工程(上海)股份有限公司设计和完成ABCA3 exon10基因片段的上下游引物,引物序列见表1。从样本中所提取的DNA中取出1~2 µL作为待扩增基因。配置PCR反应体系:35.5 µL灭菌水、1 µL 10 mmol dNTP 、5 µL Taq Buffer、1 µL上游引物、1 µL下游引物、0.5 µL Taq酶、1 µL模板、5 µL 25 mmol MgCl。PCR的循环参数:95 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s、55 ℃~60 ℃退火35 s、72 ℃延伸40~50 s,循环35次,72 ℃修复延伸5~8 min。

 

表1 引物序列

  

区域 引物序列(5'→3') 产物扩增长度/bp SC745-F CTGTCAATGTCCCACTCCTCTC 413 SC745-R TTCTCCCTAAATTACGCTGACTT 463扩增

1.2.4 PCR扩增片段琼脂糖电泳 应用电泳仪,使用1%的琼脂糖电泳检测,150 V、100 mA 20 min电泳观察PCR扩增产物的效果,确定其作为模板在光敏电阻(light dependent resistor,LDR)反应中的质量。电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于英国Syngene公司的凝胶成像分析仪进行鉴定,观察产物,并成像保存。

1.2.5 DNA目的片段的序列测定及分析 取待测序样本干冰保存寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定,所得测序结果与GenBank基因库正常序列进行比对判读,寻找ABCA3 exon10片段是否存在突变位点或等位基因多态性位点。

1.3 统计学分析

应用SPSS21.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,两组间比较采用两独立样本t检验。计数资料以百分比或率表示,组间比较采用χ2检验。采用χ2检验检测NRDS组与对照组的基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。以P<0.05为差异有统计学意义。

佛家是讲究轮回与宿命的。预知过去世,今生受者是。预知来世果,今生做者是。最早带给我们震撼与感动的是那个叫那顺的男子与叫莲花夜的妓女纠缠了三十三世的不灭情缘。每一世他们都在苦苦等待着对方的出现,每一世他们却又无可奈何的错过。他们在这红尘浊世里一次又一次的踏入轮回,一次又一次的被这无常的命运捉弄。到如今,他们是否又可以逃离命运的窠臼,解了这三世因果呢?

2 结果

2.1 两组一般情况

[5]Wert SE, Whitsett JA, Nogee LM. Genetic disorders of surfactant dysfunction [J]. Pediatr Dev Pathol, 2009, 12(4):253-274.

2.2 ABCA3 外显子10的PCR扩增电泳

用琼脂糖凝胶电泳分析PCR是否扩增出相应的目的片段,根据扩增目的片段的长度和1 000 bp Maker(图1左侧图)条带的指示,图1右侧图显示ABCA3 exon10电泳图在相应Maker条带之间显示出相应的目的片段,表示PCR扩增成功。

2.3 测序结果与分析

对病例组和对照组全部ABCA3 exon10 PCR产物

  

图1 ABCA3基因外显子10琼脂糖电泳图

测序并与GenBank基因库序列比对发现,在rs13332514(F353F)编码位点上检测出单个碱基C>T的点突变,密码子由TTC>TTT,所编码氨基酸均为苯丙氨酸。所选样本中共有23例存在该位点点突变(图2),其中病例组16例,变异率为30.2%,正常对照组有7例,变异率为13.2%,病例组的变异率显著高于对照组,差异有统计学意义(χ2=4.50,P=0.034)。ABCA3 exon10的正常测序图见图3,ABCA3 exon10 rs13332514(F353F)位点CT基因型和TT基因型序列图见图4。

法学研究要立足于新时代坚持和发展中国特色社会主义的伟大实践。积极回应社会发展中重大的宪法关切,更加注重原创性和本土性研究,把宪法学的宏大叙事与具象表达、研究的开放性与自主性结合起来。坚持中国特色社会主义的政治优势和制度优势,努力提炼并不断丰富发展具有中国特色和中国气派的宪法学理论体系、概念体系、话语体系,不断增强中国宪法学的解释力、传播力和影响力。

2.4 ABCA3 exon10(F353F)位点基因变异率与基因型频率比较

  

图2 ABCA3基因库序列(绿色代表变异位点)

  

图3 ABCA3基因外显子10正常测序图

  

图4 ABCA3基因外显子10 F353F位点测序图

 

表2 病例组与对照组患儿一般情况对比

  

项 目 病例组(n=53) 对照组(n=53) 统计量 P性别(男/女,n) 29/24 25/28 χ2=0.60 0.437胎龄(x±s)/周 32.71±2.21 32.74±2.37 t=0.08 0.937出生体质量(x±s)/g 1 914.34±560.10 1 919.06±604.29 t=0.04 0.967生产方式(剖/顺,n) 32/21 35/18 χ2=0.37 0.546产前使用糖皮质激素(是/否,n) 35/18 33/20 χ2=0.16 0.685

病例组可检出3种基因型,即CC、CT和TT型,其基因型频率分别为69.8%、20.8%和9.4%,C等位基因频率为80.2%,T等位基因频率为19.8%;对照组可检出2种基因型,即CC和CT,基因型频率分别为86.8%、13.2%,C等位基因频率为93.4%,T等位基因频率为6.6%。病例组和对照组的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ2 =4.97、0.04;P均>0.05),达到群体遗传平衡。两组基因型分布差异有统计学意义(P=0.034),病例组CC基因型比例较低,而CT和TT基因型比例较高;病例组T等位基因频率比对照组显著增高,差异有统计学意义(P=0.005),提示F353F位点C>T等位基因变异在两组之间的差异有统计学意义(表3)。

 

表3 两组基因型频率比较[n(%)]

  

注:1) Fisher精确概率法

 

组别 例数 基因型频率 等位基因频率CC CT TT C T病例组 53 37(69.8)11(20.8)5(9.4)85(80.2)21(19.8)对照组 53 46(86.8)7(13.2)0(0.0)99(93.4)7(6.6)χ2值 — 8.065 P 0.0341) 0.005

3 讨论

ABCA3蛋白在肺组织中一般呈高水平表达。体外胎鼠肺组织细胞培养可见,肺泡发育囊形期和肺泡期阶段,定位于胞浆膜上的ABCA3 mRNA会随着肺组织细胞中肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell,AEC Ⅱ)增殖而表达丰富,ABCA3蛋白含量增多,PS合成增多,形成同心圆状板层小体及胞膜外缘微绒毛样突起结构[11]。敲除了ABCA3基因的小鼠,多数生后不久便因肺表面活性物质缺乏而死亡,基因学检测发现肺组织中ABCA3 mRNA减少了85%~90%,同时与脂类代谢相关的酶类转录因子明显降低,并出现板层小体缺乏[12]。PS的合成和代谢是个精密的过程,涉及到肺器官发育、基因表达、蛋白质转录、翻译和内环境稳态等多个因素,ABCA3蛋白缺乏或功能异常致磷脂转运障碍,板层小体形成异常,进而影响到PS合成量及功能发挥,使其动态调节肺泡表面张力功能丧失,肺泡扩张受限,肺液积聚,通气-血流障碍,机体处于缺氧状态,严重者甚至引起多脏器衰竭[13]

第一种类型,即“批评与自我批评要经常开展,让咬耳朵、扯袖子,红红脸、出出汗成为常态”[2]。这种类型的监督执纪特征:监督、执纪的对象从行为上说是党员轻微的不适当行为,即行为没有违纪但有违纪的苗头或倾向;执纪的手段或方式是“咬耳朵、扯袖子”式的而且要达到“红红脸、出出汗”效果的批评教育;监督执纪运用的理想状态是“常态”化,即这种监督、执纪应经常性、普遍性开展,被提醒、被教育的党员人数相对其它三种类型都要多。这一形态针对的对象是具有违纪倾向、苗头性问题的党员,处理原则是按照党性标准加以提醒、教育、批评、管理,以防止一些倾向性、苗头性问题发展实质性问题。

ABCA3基因定位于16p13.3,由8万多个核苷酸碱基组成,可转录6 500 bp的mRNA,翻译形成1 704个氨基酸组成的相对分子质量为150 000的蛋白质。ABCA3蛋白质合成同样具有精密的调控机制,单个氨基酸改变也可能会引起能量改变或蛋白质折叠运输效率下降,进而导致磷脂转运障碍。ABCA3突变类型和突变位点的不同,尤其是个体的无义突变或剪接位点变异的存在,使得临床表型和预后难以预测[9,14]。而与SP-BSP-C相比,ABCA3基因变异谱相对较广,对于临床上NRDS患儿,尤其是近足月或足月患儿,应高度警惕是否存在ABCA3基因变异。美国相关研究证实,ABCA3基因突变是>34周新生儿发生NRDS的重要原因[15]。因此本研究着重选择胎龄较大的NRDS患儿,以期发现基因突变。

不同的社会福利政策质量评价主体所具有的个人素质、道德品质及相应的评价技术不同,能够使参与社会福利政策质量评价主体相互补充其不足之处,从而保证社会福利政策质量评价的公正性,科学性和真实有效性。

数据处理用EXCEL软件,统计分析用SPSS 17.0软件,率的比较用卡方检验,P<0.05则差异有显著性。

本研究采用基因直接测序等方法寻找ABCA3 exon10区域是否存在变异位点或多态性位点,结果显示,病例组及对照组均检测出F353F位点上存在单个碱基位点点突变C>T,密码子由TTC>TTT,所编码氨基酸未发生改变(均为苯丙氨酸)。所选样本中共有23例发生该位点突变,携带有该突变位点者占所选样本总量的21.7%,且病例组和对照组的差异有统计学意义。进一步分析发现,病例组基因型有3种:CC、CT和TT;对照组基因型有2种:CC和CT,其中 T等位基因在两组间存在显著差异。本研究的位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,在人群中具有很好的代表性。

目前观点倾向于将最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)<1%或5%考虑为低频变异,而本研究中T等位基因频率在病例组和对照组分别为19.8%和6.6%,故该位点变异暂不考虑为低频变异。国内外研究中也报道了rs13332514(F353F)多态性位点C>T与NRDS发病的相关性[21]。我国相关研究在对陕西汉族NRDS患儿F353F位点多态性研究中并未发现等位基因T与NRDS发病的相关性[22]。而本研究发现ABCA3 exon10 F353F位点处等位基因T可能会增加NRDS易感性,这可能与民族和地域性差异有关。对照组基因型中未发现纯合子TT突变,可能与样本量少有关系,但不能除外纯合子TT突变更易导致NRDS发病的可能。

同样,如果权利用尽规则不适用于这些产品的话,意味着这些产品经专利权人同意而售出后,在流转过程中上面仍然存在着专利权,该专利权最多只是默示许可给了买方及其下游买家。专利权人将对该商品保持着绝对权意义上的权利——即对该产品仍然享有专利权这种对世的无形财产权利,这显然不利于产品的流转和对其他买家有形财产权的保护。

本研究并未发现内蒙古西部地区汉族新生儿ABCA3 exon10罕见的低频变异,但ABCA3 exon10 rs13332514(F353F)位点存在多态性,T等位基因可能是导致该区汉族NRDS发生的易感因素之一。本研究系前瞻性研究,样本全部来自于内蒙古西部地区的汉族患儿,虽然在胎龄、性别、出生体质量、出生方式等基本情况方面进行了匹配,但是仍不能排除其他潜在的混杂因素可能导致的结果偏倚。由于NRDS的发病主要与胎龄有关,本研究仅选择胎龄较大的NRDS作为研究对象,胎龄越小,样本中可能由于基因突变导致的例数越少。同时,本研究所选样本中病例组和正常对照组存在不同程度变异,最小等位基因频率相对较高,且NRDS组未发现罕见的低频变异,故有待于进一步扩充样本量,以期多方位探讨致病基因及致病机制。

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病例组与对照组在性别、胎龄、出生体质量、生产方式及是否产前使用糖皮质激素等方面相比,差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

国外最新报道1例患有重度NRDS的男婴,基因检测出ABCA3 exon6位点202存在纯合子错义突变导致(p.gly202arg / G202R)GGA>AGA,甘氨酸变为精氨酸,氨基酸极性发生改变,导致ABCA3蛋白功能障碍;其父母均存在该位点错义突变GGA> AGA(c.604G> A;p.G202R),但两者肺功能均正常[16]。另有报道1例足月女婴生后出现持续性呼吸衰竭并于生后9个月进行肺移植治疗,ABCA3基因位点测序发现存在3处突变基因:R280C (c.838C>T)、V1399M (c.4195G>A)和Q1589X (c.4765C>T);其父母均存在R280C及Q1589X等位基因变异点,而在V1399M位点存在相反的等位基因变异点[17]。上述2例难治性NRDS突变位点不同,且追溯其父母均发现携带有隐性基因突变位点,但该位点变异并未致病,由此可推断,父母作为ABCA3基因位点突变的隐性携带者,通过基因遗传给了下一代,基因重组致其发病的可能。有报道47例NRDS患儿中10例存在ABCA3基因变异,其中2例纯合子、5例复合杂合子和3例杂合子突变,5例生后不久即死亡,另5例则发展为慢性肺间质性疾病[18]。我国目前关于ABCA3基因罕见位点突变致难治性NRDS发病的报道较少,而ABCA3基因多态性位点在国内外研究中提及较多,包括位点rs38464、rs2014467、rsl7135889、rs4787273等。地域不同多态性位点分布也不同,但这些多态性位点是否导致NRDS易感性增加,各地的研究结果也各异。我国研究发现rs323043位点的等位基因G可能增加早产儿NRDS风险[19];rsl7135889位点处等位基因A可能会增加广西局部地区早产儿RDS风险[20]

[2]Akella A, Deshpande SB. Pulmonary surfactants and their role in pathophysiology of lung disorders [J]. Indian J Exp Biol, 2013, 51(1): 5-22.

石墨矿矿石结构主要为鳞片变晶结构、半自形晶粒状结构,构造为片状构造、稀疏浸染状构造,局部有片麻状构造。石墨矿矿石矿物成分比较简单,主要为晶质石墨,含微量的赤铁矿、磁铁矿、褐铁矿、黄铁矿、磁黄铁矿、黄铜矿。

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现阶段我国立体绿化仅仅停留在垂直绿化或者是小范围的屋顶绿化,已经无法满足社会发展的需求。所以,政府部门要提高重视程度,出台更多的政策来宣传立体绿化理念。在我国先进科学技术的支持下,采用新媒体与传统媒体相结合的方式进行宣传,宣传新媒体主要指官方的网络平台、微博、微信等,传统媒体主要是报纸、杂志等,新媒体与传统媒体相结合的方式可以使更多的人了解立体绿化的理念。

式(5)为该工作面用支架工作阻力表示的顶板位态方程,据此,也可以通过实现“支架限定变形”工作状态而抑制工作面顶板的下沉。

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很多文化古老的民族都有关于文字如何创造的神话,比如仓颉造汉字,纳西木氏祖先牟保阿琮造东巴文等诸如此类的传说。没有文字的民族社会中的神话,主要讲述的是如何失去本来有的文字。下面以拉祜族、哈尼族、傈僳族、独龙族等藏缅语诸民族的神话文本为例,讨论他们的“无文字”文化逻辑。

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张钰恒,王晓磊,梅花,张艳波,曹晓梅
《临床儿科杂志》 2018年第04期
《临床儿科杂志》2018年第04期文献

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