卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌，位居生殖道恶性肿瘤第二位，死亡率则位居女性恶性肿瘤第5位、生殖道恶性肿瘤首位，经规范手术及辅助化疗后患者5年生存率约为47%[1]。这是由于早期卵巢癌缺乏典型的临床症状，约2/3的患者在临床确诊时已发生了盆腹腔转移，而其中约2/3在5年内死于肿瘤的复发与转移[2]。因此，提高卵巢癌治疗效果、改善预后的关键在于如何控制肿瘤的复发与远处转移。受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)在控制细胞增殖和分化的信号转导通路中扮演重要的角色，并参与肿瘤的发生与发展。盘状结构域受体1(discoidin domain receptor 1，DDR1)蛋白是RTKs中的一员，在垂体腺瘤、肺癌、乳腺癌等肿瘤中高表达[3-5]。本研究分析DDR1蛋白在卵巢癌中的表达情况及其临床意义，现报告如下。

1.2.1 抗病酶活性测定。2015年在公主岭南崴子进行。7月9日田间喷施公主岭霉素水浸提液。施药前取样并每隔3 d取样1次，连续取样10次，样品于-80 ℃保存备用。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性采用苯丙氨酸紫外吸收法[4]测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑自氧化法[5]测定；β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性采用还原糖测定法[6]测定。分别以春雷霉素和清水作为阳性和阴性对照，设3次重复。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集2013年1月至2017年6月在广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的94例原发性卵巢癌患者的肿瘤组织标本，均经病理学确诊。患者年龄28～83岁，中位年龄51岁。其中浆液性腺癌82例，黏液性腺癌1例，子宫内膜样腺癌3例，透明细胞腺癌2例，其他类型卵巢恶性肿瘤6例。按2014年国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)的标准[6]进行手术病理分期，其中Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期82例。对卵巢癌患者均进行随访，随访时间1～52个月(中位时间为15个月)，均无非癌死亡及失访病例。另收集同期在我院诊治的43例卵巢良性肿瘤患者的肿瘤组织标本，患者年龄12～64岁，中位年龄36岁。正常卵巢组织来源于因子宫肌瘤或子宫腺肌症而行卵巢切除的患者，共33例，年龄43～62岁，中位年龄49岁。

1.2 主要试剂 兔抗人DDR1一抗购自Cell Signaling Technology公司(批号：5583S、005583S000306092017)，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(批号：SP-9000，WK161525)，0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液溶液(批号：MVS-0066、17062703)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS，批号：PBS-0060，17082901)及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂(批号：1610110031)均购自迈新生物技术有限公司。

1.3 DDR1蛋白表达的检测 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶联结法检测各组织的DDR1蛋白表达情况，具体操作步骤参照说明书进行，最后以DAB染色，苏木精复染后封片。选用已知阳性表达的乳腺癌组织作为阳性对照，空白对照以PBS替代DDR1兔抗人一抗。

1.4 结果判断 由两位病理科医生独立对所有免疫组化组织切片进行阅片与评分，采用免疫组化染色评分(immunoreactive score，IRS)进行结果判读[7]。每张切片在高倍镜(×400)下随机选取无坏死区域的5个视野，每个视野观察100个细胞，在细胞膜或细胞质中显现棕黄色微粒者判断为DDR1蛋白染色阳性。根据阳性细胞数及其胞质或胞浆内颗粒染色强度评分之积作为每个视野的得分，染色强度计分标准：不着色(-)为0分，浅棕黄色(+)为1分，棕黄色(++)为2分，棕褐色(+++)为3分。阳性细胞数计分标准：无为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。取5个视野得分的平均值作为该切片的染色得分，>3分定义为DDR1蛋白阳性表达。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23软件进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验；单因素及多因素分析采用非条件logistic模型。单因素分析以P<0.10为差异有统计学意义，其他检验以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同卵巢组织中DDR1蛋白的表达情况比较 DDR1蛋白在正常卵巢上皮细胞未见表达，部分区域见有极浅黄色着色区域，按IRS评分标准为阴性；DDR1蛋白在良性卵巢肿瘤细胞中的表达主要集中在细胞膜上，细胞质也可看见浅棕黄色着色；而DDR1蛋白在卵巢癌细胞中的细胞膜及胞浆中均可见着色颗粒分布。见图1。DDR1蛋白在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及卵巢癌组织中的阳性表达率分别为0、11.63%(5/43)、55.32%(52/94)，差异有统计学意义(χ2=45.926，P<0.001)，其中卵巢癌组织的阳性表达率均高于卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织(χ2=23.181、30.912，均P<0.001)，而正常卵巢组织与良性卵巢肿瘤组织的阳性表达率比较，差异无统计学意义(χ2=2.433，P=0.119)。

  

图1 DDR1蛋白在各卵巢组织中的表达情况(SP染色，×400)

注：A：卵巢癌组织的阳性表达；B：卵巢癌癌组织的阴性表达；C：卵巢良性肿瘤组织的阳性表达；D：卵巢良性肿瘤组织的阴性表达；E：正常卵巢组织阴性表达；F：阳性对照乳腺癌组织的阳性表达；G：阴性对照的阴性表达。

2.2 不同临床病理特征卵巢癌患者的DDR1蛋白表达情况比较 FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期者、低分化者、有腹腔转移者的DDR1蛋白表达阳性率分别高于Ⅰ～Ⅱ期者、中-高分化者、无腹腔转移者(均P<0.05)，见表1。

 

表1 不同临床病理特征卵巢癌患者的DDR1蛋白表达情况比较[n(%)]

  

临床病理因素nDDR1蛋白阳性表达χ2值P值FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期12822(16．67)50(60．98)8．3150．004组织学分级中-高分化低分化20746(30．00)46(62．16)6．5890．010组织学类型浆液性黏液性子宫内膜样透明细胞性其他类型82132647(57．32)1(100．0)1(33．33)1(50．0)2(33．33)2．7230．605腹水量<500ml≥500ml346020(58．82)32(53．33)0．2650．607腹腔转移有无633142(66．67)10(32．26)9．9520．002淋巴结转移有无253115(60．00)12(38．70)2．5120．113▲

注：▲在已切除淋巴结的患者中的比较。

2.3 影响卵巢癌患者预后的单因素、多因素分析 以年龄、FIGO分期、组织学分级、腹腔转移情况、腹水量及DDR1蛋白表达情况为自变量，以患者生存情况为因变量，进行logistic单因素分析，变量赋值情况见表2。单因素分析结果显示，腹腔转移情况及DDR1蛋白表达情况、FIGO分期与卵巢癌患者预后有关(均P<0.10)。见表3。将FIGO分期、腹腔转移情况及DDR1蛋白表达情况纳入多因素分析，结果显示，腹腔转移与DDR1蛋白阳性是卵巢癌患者死亡的危险因素(均P<0.05)。见表4。

 

表2 变量赋值情况

  

变量赋值年龄<40岁=1，≥40岁=2FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期=1，Ⅲ～Ⅳ期=2组织学分级中～高分化=1，低分化=2腹腔转移情况无=1，有=2腹水量<500ml=1，≥500ml=2DDR1蛋白阴性=1，阳性=2生存情况(因变量)存活=1，死亡=2

 

表3 影响卵巢癌患者预后的单因素分析

  

变量β值SE值Waldχ2值P值OR值(95%CI)年龄-0．3360．6020．3130．5760．714(0．220，2．322)FIGO分期-1．4630．8063．2970．0690．232(0．048，1．123)组织学分级-0．4020．5240．5890．4430．669(0．240，1．868)腹腔转移-1．8720．55011．5730．0010．154(0．052，0．452)腹水量-0．0880．4350．0410．8390．915(0．390，2．148)DDR1表达-1．9170．48515．593<0．0010．147(0．057，0．381)

 

表4 影响卵巢癌患者预后的多因素分析

  

变量β值SE值Waldχ2值P值OR值(95%CI)腹腔转移-1．5190．5836．7970．0090．219(0．070，0．686)DDR1表达-1．6410．50710．4650．0010．194(0．072，0．524)FIGO分期0．1581．0280．0240．8781．171(0．156，8．783)

3 讨 论

DDR1是RTKs中的一员，可以被所有类型的细胞外基质的主要成分-胶原蛋白激活，磷酸化后可启动下游的信号传导途径调节细胞活动。DDR1的过表达可以激活丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰基醇3-激酶、Janus激酶和核转录因子-κB通路[8]。DDR1在细胞分化、增殖、黏附、迁移中起重要作用，同时也具有促进细胞恶性转化及肿瘤侵袭、转移的作用[9-10]。

在乳腺癌和卵巢癌中，与周围正常上皮细胞相比，DDR1转录产物在肿瘤细胞中的表达上调至少3倍[11-13]。本研究结果显示，卵巢癌中DDR1的阳性显色主要位于细胞膜及细胞质中，其表达阳性率为55.32%，均高于正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织(11.63%)(均P<0.05)，而DDR1蛋白在正常卵巢组织中并不表达，在良性卵巢肿瘤组织中仅呈低表达，提示DDR1可能在卵巢癌的发生中起重要作用。此外，FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期者、低分化者、有腹腔转移者的DDR1蛋白表达阳性率分别高于Ⅰ～Ⅱ期者、中-高分化者、无腹腔转移者(均P<0.05)，这提示DDR1可能在卵巢癌的发展、转移中起重要作用。有学者报告DDR1调控肿瘤细胞侵袭转移的可能机制。Gao等[14]对通路共享数据库分析发现，跨膜蛋白4超家族成员1抗体(transmembrane 4 L6 family member 1，TM4SF1)与胶原RTKs的DDR1和皮质骨架的多酚体聚糖结合蛋白2存在间潜的相互作用，进一步研究发现在胶原蛋白-1的促进作用下TM4SF1可与DDR1结合，同时TM4SF1还招募多酚体聚糖结合蛋白2、蛋白激酶C-α，并激活Janus激酶、信号转导子和转录激活子3，从而诱导整个非经典DDR1信号通路调控休眠静息状态的乳腺癌细胞在多个远处组织产生转移灶。此外，DDR1可以通过胶原蛋白介导细胞-基质相互作用的促细胞存活信号，还可以与Notch1信号产生相互作用[15]，通过Notch1受体Jagged-1诱导溶骨性骨转移[16]，DDR1调控的信号通路有效地参与癌细胞进入骨微环境，阻断这个信号通路可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭、骨蛋白水解和破骨细胞降解，并提高实验动物的生存率[17]。然而，DDR1在卵巢癌中调控肿瘤细胞侵袭转移的机制尚未清楚，还需进一步研究分析。

多因素分析结果显示，DDR1蛋白表达阳性和腹腔转移是卵巢癌患者死亡的危险因素(均P<0.05)，而FIGO分期却不是影响其生存的因素(P>0.05)，这可能与纳入的病例数较少有关。肿瘤的转移可影响患者的预后，而DDR1蛋白所调控的一系列信号通路又与肿瘤的侵袭、转移相关，因此推测DDR1或可成为评估卵巢癌恶性程度的标记，并可用于判断患者预后情况。有文献报告，在重组免疫毒素作用时，胶原蛋白通过激活DDR1以保护肿瘤细胞免受其杀伤，抑制DDR1时则增强重组免疫毒素的杀伤作用，因此联合使用DDR1抑制剂与重组免疫毒素可提高肿瘤免疫治疗的临床疗效[18]。目前已有许多靶向DDR1的抑制剂[19]，且有研究表明DDR1和Notch信号的联合抑制对KRAS驱动的肺腺癌的治疗有效[20]。因此，我们推测DDR1或可成为卵巢癌靶向治疗的一个靶点，通过靶向抑制DDR1的功能降低卵巢恶性肿瘤细胞的侵袭、转移能力，从而改善卵巢癌患者预后。

综上所述，DDR1蛋白高表达于卵巢癌组织，其可能在肿瘤的发生、发展中扮演关键角色，并有可能成为评估预后的因子和卵巢癌防治的分子靶点。

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参 考 文 献

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