目前，肥胖症患病率在世界范围内呈持续增长的趋势，其对个人和医疗系统造成了一定的负担。肥胖常会引起机体的炎症反应，而这会增加很多疾病的发生风险，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和冠脉疾病最为常见[1]。肥胖合并T2DM者机体处于低度慢性炎症状态，这种炎症状态以循环中高水平的促炎性细胞因子和脂肪酸为特征，可干涉胰岛素发挥正常功能，进而造成胰岛素抵抗[2]，同时其也与胰岛B细胞的功能异常有关[3]。此外，近期有研究表明，导致糖尿病的根本原因是机体细胞的慢性缺氧状态。因此，发掘同时对糖尿病及其相关的炎症和缺氧状态均有干预作用的药物具有重要意义。吡格列酮(pioglitazone，PGZ)是过氧化物酶小体生长因子活化受体-γ的高选择性有效配体，在临床上作为一种胰岛素增敏剂被广泛用于治疗T2DM，同时其可以促进脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞的分化以及肥大脂肪细胞的凋亡，并减少脂肪细胞炎症因子的产生[4]。本研究拟观察PGZ对Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠胰岛素抵抗、外周血单核细胞亚群以及脂肪组织炎症因子、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、缺氧诱导因子1-α(hypoxia induced factor 1，HIF1-α)表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：C)，诺和灵精蛋白生物合成人胰岛素注射液(万邦医药，批号：21512201)；盐酸吡格列酮片(天津武田药品有限公司，批号：J20140082)，抗鼠CD43(Thermo公司，批号：#RE2205621)，抗鼠CD172(BioLegend公司，批号：B187123)，SYBR Green Master(ROX)(Roche公司，批号：14759700)。电子天平(上海天平仪器厂)，血糖仪(万大夫，型号：ZSG-400)，血糖试纸(万大夫，批号：20160728)，ABI Prism®7300型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)，FC500 MCL流式细胞仪(Beckman Coulter公司)。

1.2 实验动物及干预方法 40只6～8周的雄性ZDF模型大鼠购自北京维通利华实验动物有限公司[许可证号SCXK(京)2012-0001]，体重200～300 g。采用随机数字表法将大鼠分为PGZ模型组、生理盐水模型组、PGZ对照组和生理盐水对照组各10只。用维通利华公司推荐饲料Purina #5008(粗蛋白23.5%、粗脂肪6.5%)对所有大鼠进行高脂喂养以诱导肥胖和高糖血症，每日不限饮水，造模期间每周测定并比较各组大鼠的体重和FBG水平，模型组平均体重超过对照组20%且FBG水平达到7.0 mmol/L以上视为造模成功。造模成功后，取颌下静脉血0.5～1 ml置于肝素抗凝管，进行单核细胞亚群分析。然后开始对PGZ模型组和PGZ对照组大鼠进行PGZ灌胃，剂量为10 mg/(kg·d)，1次/d，其余两组给予相同体积的生理盐水灌胃。持续干预10周，给药干预期间每周记录体重1次。干预结束后再次测定FBG，并行腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)和腹腔胰岛素耐量试验(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)，取颌下静脉血0.5～1 ml置于肝素抗凝管，行单核细胞亚群分析，然后麻醉处死动物，取肾周脂肪，测量有关指标。

1.3 体重、血糖的测量方法 使用电子天平测量清晨体重。血糖测量前空腹8～10 h，采血针刺破鼠尾静脉，以血糖试纸蘸取血液，使用血糖仪测定FBG。

1.4 IPGTT与IPITT (1)为评估胰岛素抵抗，各组大鼠禁食12 h后行IPGTT。经尾静脉测定FBG后，给予腹腔注射葡萄糖1 g/1 kg(体重)，于注射葡萄糖后15 min、30 min、60 min、120 min分别从尾静脉取血测定血糖水平，方法同1.3，根据试验结果计算血糖曲线下面积。(2)为评估胰岛素敏感性，各组大鼠空腹4 h后行IPITT。经尾静脉测定FBG后，给予腹腔注射胰岛素1单位/1 kg(体重)，于注射胰岛素后15 min、30 min、60 min、120 min分别从尾静脉取血测定血糖水平，方法同1.3。

1.5 单核细胞亚群分析 于造模前、造模结束后及干预10周后，取5 μl抗鼠CD43、1 μl抗鼠CD172a与30 μl抗凝血和14 μl细胞染色缓冲液均匀混合，避光室温孵育15 min。之后加入600 μl红细胞裂解液避光室温孵育10 min。然后上机检测，用FlowJo 7.6.1软件分析流式细胞术数据。

1.6 肾周脂肪组织炎症和缺氧相关因子mRNA表达情况的分析 取动物肾周脂肪后，充分研磨组织，用Trizol和氯仿等试剂提取RNA，通过反转录得到cDNA后，使用SYBR Green Master Mix荧光定量PCR仪进行PCR反应。将样本cDNA 和引物提前从-80℃冰箱中取出，冰上融化。高压灭菌超纯水分别将cDNA和引物分别稀释至25 ng/μl和 5 μmol/ml，冰上静置备用。根据FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂说明书配制反应体系。全程冰上操作，加入2×SYBR Green Master(ROX)后避光操作，内参与检测样本均设置复孔。实时荧光PCR反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，40个循环。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)作为内参，PCR引物如表1所示。将定量结果标准化，并根据2-△△CT的公式计算。

 

表1 PCR引物序列

  

基因序列(5′⁃3′)长度(bp)HIF1⁃α上游：TCATCCAAGAAGCCCTAACG109下游：TCGCTTTCTCTGAGCATTCTGTNF⁃α上游：TGACCCCCATTACTCTGACC161下游：GGCCACTACTTCAGCGTCTCIL⁃6上游：CTGGTCTTCTGGAGTTCCGT219下游：TGGTCCTTAGCCACTCCTTCTGAPDH上游：GCCAAAAGGGTCATCATCTCCGC318下游：GGATGACCTGCCCACAGCCTTG

1.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组IPGTT结果比较 4组的血糖比较，差异有统计学意义(F组间=99.298，P组间<0.001)，各时间点，生理盐水模型组的血糖均高于其他3组(均P<0.05)，PGZ模型组30min、60min、120min的血糖均高于PGZ对照组及生理盐水对照组(P<0.05)；各组血糖均有随时间变化的趋势(F时间=42.356，P时间<0.001)；分组与时间有交互效应(F交互=8.759，P交互<0.001)。见表2。

 

表2 4组IPGTT结果比较(x±s，mmol/L)

  

组别n0min15min30min60min120minPGZ模型组107．300±1．1209．920±0．74613．360±0．976#16．680±2．332#16．080±2．901#生理盐水模型组1021．120±5．608∗21．917±3．799∗23．833±4．381∗28．700±5．618∗28．883±3．998∗PGZ对照组104．957±0．4478．557±2．3088．729±01．9578．157±1．1376．071±0．702生理盐水对照组105．162±0．1516．813±1．4837．575±1．8937．838±1．7927．100±2．583

注：在对应时间点与其他组比较，*P<0.05；在对应时间点与PGZ对照组及生理盐水对照组比较，#P<0.05。

2.2 4组IPITT结果比较 4组的胰岛素比较，差异有统计学意义(F组间=123.043，P组间<0.001)，各时间点，生理盐水模型组的胰岛素均高于其他3组(均P<0.05)，PGZ模型组30 min的胰岛素均高于PGZ对照组及生理盐水对照组(均P<0.05)；各组胰岛素均有随时间变化的趋势(F时间=68.872，P时间<0.001)；分组与时间有交互效应(F交互=7.786，P交互<0.001)。见表3。

 

表3 4组IPITT结果比较(x±s，mmol/L)

  

组别n0min15min30min60min120minPGZ模型组107．600±0．8947．000±0．8125．940±1．137#4．400±0．9773．580±2．075生理盐水模型组1016．180±2．707∗15．080±2．480∗14．920±1．346∗8．980±0．756∗5．940±1．422∗PGZ对照组105．550±0．5575．250±0．6193．175±0．3592．100±0．4081．850±0．412生理盐水对照组106．567±0．4164．967±1．4012．933±0．3792．033±0．4161．567±0．058

注：在对应时间点与其他组比较，*P<0.05；在对应时间点与PGZ对照组及生理盐水对照组比较，#P<0.05。

2.3 4组单核细胞亚群分布情况 4组抑炎型单核细胞(CD172a+/CD43++)占单核细胞总数(CD172a++)的比例比较，差异有统计学意义(F组间=35.845，P组间<0.001)，其中造模成功后，PGZ模型组与生理盐水模型组的比例均低于PGZ对照组和生理盐水对照组(均P<0.05)，干预10周后生理盐水模型组的比例低于其他3组(P<0.05)；4组抑炎型单核细胞占单核细胞总数的比例均有随时间变化的趋势(F时间=34.537，P时间<0.001)；分组与时间有交互效应(F交互=11.370，P时间<0.001)。见表4。

1.3 观察指标 两组早产儿在 纠正月龄1个月、6个月、12个月时进行头围、身长、体重的测量，采用智力发育指数(MDI)及运动发育指数(PDI)量表对早产儿的机体和智力发育情况进行评价，<70分为发育异常；采集两组早产儿外周静脉血2 ml，置于AXTGL20M血清离心机内，2 000 r/min，离心15 min后取出分离好的血清冷藏保存待检，分别采用ELISA法和采用流式细胞术法对早产儿的免疫状态指标CD3+、CD4+及FEER、RBCC3bR水平进行测定，将检测结果核对记录并比较分析差异。

 

表4 4组单核细胞亚群分布情况比较(x±s，%)

  

组别n造模前造模成功后干预10周后PGZ模型组1095．820±4．50377．450±7．659△94．790±2．152生理盐水模型组1092．460±3．69475．140±7．487△77．950±6．934∗PGZ对照组1092．870±5．69090．320±5．98393．530±5．181生理盐水对照组1094．250±2．73493．250±4．23195．330±2．620

注：在对应时间点与PGZ对照组和生理盐水对照组比较，△P<0.05；在对应时间点与其他3组比较，*P<0.05。

2.4 4组脂肪组织炎症和缺氧相关指标比较 干预10周后，其他3组的脂肪组织炎症指标(TNF-α和IL-6)及缺氧相关指标(HIF1-α)的mRNA相对表达水平均低于生理盐水模型组(均P<0.05)，而PGZ模型组、PGZ对照组和生理盐水对照组间比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表5。

 

表5 4组大鼠脂肪组织炎症和缺氧因子mRNA相对表达水平比较(x±s)

  

组别nHIF1⁃αIL⁃6TNF⁃αPGZ模型组101．285±0．2400．394±0．0360．725±0．144生理盐水模型组102．859±0．234∗3．321±0．710∗5．803±0．670∗PGZ对照组101．341±0．3450．642±0．0641．123±0．043生理盐水对照组101．139±0．1430．742±0．0141．004±0．123 F值26．84629．50097．105P值<0．0010．004<0．001

注：与其他3组比较，*P<0.05。

3 讨 论

机体的慢性间歇缺氧状态(如阻塞性睡眠呼吸暂停相关)可能是导致胰岛素抵抗和T2DM发病的重要因素。研究表明，机体系统的夜间间歇性缺氧与中年男性发生T2DM风险的增加有关[11]。从器官及组织水平来看，Ye[12-13]的研究团队首先提出由脂肪细胞增生肥大所导致的脂肪组织缺氧在促进肥胖个体慢性炎症、脂联素减少、脂肪细胞功能异常甚至死亡中扮演着核心角色。随后该团队还发现，HIF1-α以及由缺氧引起的其他信号机制可能通过抑制胰岛素信号通路和诱导细胞死亡进而促使脂肪细胞释放自由脂肪酸并抑制其摄取葡萄糖[14]。本研究中，造模成功后生理盐水模型组的脂肪组织HIF1-α mRNA相对表达水平高于生理盐水对照组(P<0.05)，提示肥胖T2DM大鼠的组织处于缺氧状态；而经PGZ干预后，PGZ模型组的HIF1-α mRNA相对表达水平低于生理盐水模型组(P<0.05)，且与两个对照组无差异(P>0.05)，提示PGZ可以缓解T2DM的缺氧状态。而Xi等[15]认为当前缺氧与肥胖和T2DM的关系尚未明了，究竟间歇性缺氧是胰岛素抵抗和T2DM的致病因素[16]，还是适度的间歇性缺氧有助于缓解肥胖和T2DM[17]，有待进一步的研究证实。

肥胖是糖尿病的主要危险因素之一[5]，但联系两者的机制尚未完全阐明。炎症是联系肥胖和糖尿病的一个重要环节，同时也是T2DM的一个独立危险因素[6]。炎症发生于各种形式的病理性刺激反应和组织损伤中，并且慢性炎症和免疫系统的激活可能是肥胖相关的代谢疾病(如T2DM)进展的主要原因[7-9]。炎症通过多种通路在糖尿病进程中发挥作用，而炎症介质在T2DM病因学上的确切分子机制尚未清楚，Aggarwal等[5]发现肥胖时会伴随多种炎性介质水平的升高，这些炎症介质会促进胰岛素抵抗的产生，如TNF-α通过诱导胰岛素受体底物-1的丝氨酸磷酸化，抑制脂肪细胞中胰岛素受体的酪氨酸激酶活性，进而引起胰岛素抵抗。而一些炎症介质除了自身可以促进胰岛素抵抗，还能诱导其他炎症介质的上调或抗炎因子的下调，从而间接促进胰岛素抵抗。van Greevenbroek等[3]指出，炎症因子如TNF-α、IL-6、饱和脂肪酸等可以通过胰岛素受体底物和磷脂酰肌醇-3激酶途径活化丝氨酸/苏氨酸激酶，从而阻碍胰岛素信号的传递。Luft等[10]认为，机体内部介质的运转必须适应于机体不同时期的不同需求，即代谢随感官的需求而改变。在这个理论中，胰岛素在感官的需求增加时是一个发挥作用的重要信号分子，而当机体的需求处于防御状态时(比如炎症介质的信号)，代谢活动将被调整，胰岛素抵抗系统使能量的消耗最小化；当炎症转为慢性状态时，会造成代谢通路的慢性调整。本研究结果显示，生理盐水模型组抑炎型单核细胞占单核细胞总数的比例低于生理盐水对照组(P<0.05)，而TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平、各个时间点的血糖及胰岛素水平均高于生理盐水对照组(P<0.05)，提示在造模成功后肥胖T2DM大鼠机体处于炎症状态，而胰岛素敏感性下降、胰岛素抵抗水平提高，这与上述理论相符。经过PGZ干预10周后，PGZ模型组的各个时间点的血糖及胰岛素水平、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平均低于生理盐水模型组，而抑炎型单核细胞占单核细胞总数的比例高于生理盐水模型组(P<0.05)，且TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平、抑炎型单核细胞比例与两个对照组无差异(P>0.05)，提示PGZ在发挥降糖及胰岛素增敏的同时，对T2DM所致炎症确实有改善作用。

看了一阵红颜薄命的落花，想了一回隐秘的心事，红琴的心里更加燥热起来，一路上的知了没命地叫，叫得她更加的心烦意乱，她想撕烂它们的嘴却无从下手，就捡起一块小石子朝树枝上扔去，那只绿色的鸣蝉受了惊，洒下一泡屎飞走了。有朝一日要是自己也悄无声息地凋谢了，那岂不是白活了一场？作为一个女人，夜夜是空的，活着还有什么意思？

总之，PGZ可改善肥胖T2DM大鼠的胰岛素抵抗，同时对其炎症和缺氧状态也有缓解作用。

再次，培养员工对挫折的承受力。随着培训工作对培训公寓的服务接待工作要求越来越高，员工也将面临更多的工作考验，难免会遇到各种各样的挫折，情绪低落。所以必须加强培养员工顽强的意志和面对挫折勇敢承受的心理。要让员工明白工作没有一帆风顺的，每一项工作都是在不断完善后才能更畅通。要教会员工 “吾尽吾心，终亦无悔”的道理，让员工一定正视现实，认识到无论什么困难，只有尽了自己的“志”与“力”，才能克服困难，不留遗憾。如果能及时引导、启发员工不畏困难，不仅有助于培养员工承受挫折的能力，还能有效锻炼员工的工作能力和提高培训公寓的服务水平。

参 考 文 献

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