成人骨髓含有内皮样细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、骨细胞、脂肪细胞、间充质干细胞等多种细胞，其中以脂肪细胞的含量最为丰富，可占据骨髓腔容积的50%以上，老年时其可占据90%以上的骨髓腔容积[1]。作为骨髓微环境的重要组分，骨髓脂肪细胞不仅占据非造血的骨髓腔空间，还具有多方面的生理功能[2]，并在多种疾病的病理过程中扮演重要角色[3-4]，可能与白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等血液系统疾病的发病、预后有密切关系[5-6]。

目前，对人体内骨髓脂肪细胞的研究存在许多困难，如从人体获取的骨髓液中脂肪细胞含量少、成熟脂肪细胞体外存活时间短等，因而主要采用将骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法进行体外研究。但在常用的二维培养系统中，骨髓间充质干细胞的成脂分化率较低，导致成脂体系中混杂着较多未分化的骨髓间充质干细胞，这对进一步的实验研究造成较大的干扰。因此，通过优化培养条件促进骨髓间充质干细胞体外增殖和提高成脂分化的效率具有重要意义。

锌是人体的一种必需微量元素，有研究表明锌具有胰岛素样作用，可作用于与葡萄糖摄取相关的胰岛素受体和胞内磷脂酰肌醇激酶，促进葡萄糖的转运和利用及TG的合成和聚积[7]。这提示锌可能有利于间充质干细胞成脂分化过程中细胞对葡萄糖的转运和利用及脂质的合成和聚积，从而促进其成脂分化。本研究采用密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，hBM-MSC)并进行体外扩增培养，分析锌对hBM-MSC增殖、成脂分化的影响，并检测相关成脂基因氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPAR-γ)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)的表达水平，探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 人外周血单个核细胞分离液购自挪威Axis-Shield公司(生产批号：1114740)，七水硫酸锌购自国药集团化学试剂有限公司(生产批号：10024028)，低糖杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)购自美国HyClone公司(生产批号：11885084)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰酶购自美国Gibco公司(生产批号：10100147、25300054)，胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、吲哚美辛购自美国Sigma-Aldrich公司(生产批号：I9278、D4902、I7018、I7378)，细胞计数试验(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司(生产批号：CK04)，油红O染色液、0.4%台盼蓝染液购自北京索莱宝科技有限公司(生产批号：G1260、C0040)，TRIzol®试剂购自美国Invitrogen公司(生产批号：15596018)，RNA反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司(生产批号：RR037A、RR420A)。PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。NanoDrop 2000超微量分光光度计、Sorvall LegendTM XTR 120VAC型冷冻微量离心机、MultiskanTM FC型酶标仪、Forma CO2培养箱购自美国Thermo Fisher公司，7500实时荧光定量PCR系统、VeritiTM 96孔PCR热循环仪购自美国Applied Biosystems公司，Cellometer Mini自动细胞计数仪购自美国Nexcelom公司，精密天平购自德国Sartorius公司(型号：BSA124S)，荧光倒置及正置显微镜(型号：CKX41)、显微镜CCD成像系统(型号：DP22)购自日本Olympus公司。

1.2 细胞分离和培养 本研究所用的hBM-MSC分离自具有正常骨髓象的患者骨髓液标本，共10例，年龄30～60岁，均符合医学伦理要求。取骨髓液2 ml，肝素抗凝后用人外周血单个核细胞分离液分离单个核细胞。计数细胞，用含10% FBS的低糖DMEM培养液(含100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素)将浓度调至1×104个/ml后接种在培养瓶中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养。72 h后弃去悬浮细胞，继续培养，每隔2～3 d换液1次，待细胞融合后用胰酶消化，进行常规传代培养1～2次后即可获得hBM-MSC。

1.3 hBM-MSC生长曲线测定 将hBM-MSC以6.4×103个/孔接种于96孔细胞培养板，分成9组，每组5孔，向每孔加入低糖DMEM完全培养基，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养。每3 d换液1次。每天取1组细胞，吸去低糖DMEM完全培养基，用1×PBS洗3次，向每孔加100 μl含10%体积分数CCK-8的低糖DMEM，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内孵育4 h。在酶标仪上450 nm波长处测定各孔吸光度值(A值)，连续检测9 d，根据每天的测定结果绘制细胞生长曲线。实验重复3次，分别采用3个骨髓标本来源的细胞。

1.4 hBM-MSC的活性检测 将hBM-MSC以6.4×103个/孔接种于96孔细胞培养板，分成6组，每组5孔，对照组加入不含锌的低糖DMEM完全培养基，其余5个锌处理组加入锌浓度分别为0.001 mmol/L、0.004 mmol/L、0.016 mmol/L、0.064 mmol/L、0.256 mmol/L的含锌低糖DMEM完全培养基，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养。根据细胞生长曲线，在细胞增殖速度最快的时间点检测细胞活性。吸去低糖DMEM完全培养基，用1×PBS洗3次，向每孔加100 μl含10%体积分数CCK-8的低糖DMEM培养基，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内孵育4 h。在酶标仪上450 nm波长处测定各孔A值，计算细胞活性，细胞活性(%)=锌处理组A值/对照组A值×100%。实验重复3次，分别采用3个骨髓标本来源的细胞。

1.5 成脂诱导培养基的配制 (1)成脂诱导培养基A液的配制：室温解冻后，将500 μl IBMX储存液、50 μl地塞米松储存液、500 μl胰岛素储存液、50 μl吲哚美辛储存液和5 ml FBS加入43.9 ml低糖DMEM中，轻晃以确保混合均匀，用0.22 μm过滤器过滤后置于4℃冰箱保存备用。(2)成脂诱导培养基B液的配制：室温解冻后，将500 μl胰岛素储存液和5 ml FBS加入44.5 ml低糖DMEM中，轻晃以确保混合均匀，用0.22 μm过滤器过滤后置于4℃冰箱保存备用。(3)含锌的成脂诱导培养基：用精密天平称取0.037 g七水硫酸锌分别溶解于50 ml上述成脂诱导培养基A液、B液中，配制成锌浓度为2.56 mmol/L的成脂诱导培养基，再稀释(稀释液为不含锌的成脂诱导培养基A、B液)成锌浓度分别为0.001 mmol/L、0.004 mmol/L、0.016 mmol/L、0.064 mmol/L的成脂诱导培养基A液、B液，轻晃以确保混合均匀，用0.22 μm过滤器过滤后置于4℃冰箱保存备用。

1.6 hBM-MSC诱导成脂分化 将hBM-MSC以2×104个/cm2的密度接种于24孔细胞培养板，每孔加入低糖DMEM完全培养基2 ml，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，每3 d换液1次。单层生长的细胞完全融合后再继续培养3～4 d达到接触抑制。将细胞分为5组，其中4个实验组分别用含锌浓度为0.001 mmol/L、0.004 mmol/L、0.016 mmol/L、0.064 mmol/L的成脂诱导培养基A液培养，3 d后分别换成含锌浓度为0.001 mmol/L、0.004 mmol/L、0.016 mmol/L、0.064 mmol/L的成脂诱导培养基B液继续培养1 d，此过程为1个循环的诱导，培养3个循环后继续用含锌的成脂诱导培养基B液维持培养至21 d，期间每3 d换液1次。对照组用不含锌的成脂诱导培养基A液及B液进行相同的成脂诱导。

1.7 油红O染色 hBM-MSC诱导成脂21 d后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS，pH7.4)洗涤两次，然后用4%中性福尔马林固定30 min，0.5%油红贮存液(溶于异丙醇)用水按3 ∶2稀释，0.45 μm滤膜过滤，固定后的细胞用此稀释液室温孵育30 min后，蒸馏水漂洗细胞3次，在倒置显微镜下拍照。随后加入异丙醇，10 min后于酶标仪492 nm处读取的A值。成脂效率(%)=锌处理组A值/对照组A值×100%。

1.8 成脂基因mRNA表达水平检测 收集诱导成脂21 d的hBM-MSC，用TRIzol试剂提取总RNA，测定总RNA浓度，A260/A280均在1.8～2.0之间。应用反转录试剂盒合成cDNA，按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书方法配制20 μl PCR反应体系，采用实时荧光定量PCR法检测成脂相关基因mRNA相对表达量。实时荧光定量PCR引物见表1。PCR扩增条件为：95℃ 10 min，然后95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环。实验重复3次，每组3个复孔，分别计算同一样品3个复孔的Ct值，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照，根据2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.9 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表1 PCR引物序列

  

基因引物序列(5′⁃3′)NCBI序列号PPARγ上游：GATACACTGTCTGCAAACATATCACAANM＿015869．4下游：CCACGGAGCTGATCCCAAFABP4上游：GCTTTGCCACCAGGAAAGTGNM＿001442．2下游：ATGGACGCATTCCACCACCAC/EBPα上游：AAGAAGTCGGTGGACAAGAACAGNM＿004364．4下游：TGCGCACCGCGATGTβ⁃actin上游：GGGACCTGACTGACTACCTCNM＿001101．3下游：TCATACTCCTGCTTGCTGAT

2 结 果

2.1 hBM-MSC的生长形态学观察 hBM-MSC在接种后数小时内开始贴壁，24 h后基本全部贴壁，细胞呈长梭形或长多边形，形成若干个集落，见图1 A；随后细胞迅速扩增，集落呈放射状向周围扩散，相邻集落开始接触、融合；接种后第7天细胞可融合至80%～90%，排列成旋涡状生长，见图1B。

  

图1 hBM-MSC的生长形态学观察(×40)

 

注：A为细胞接种后第6天；B为细胞接种后第7天

2.2 hBM-MSC的生长曲线 hBM-MSC接种后第1天处于贴壁过程，生长相对停滞；从第2天起细胞开始缓慢增长，处于生长潜伏期；从第5天起细胞增殖速度显著加快，细胞倍增时间明显缩短，至第6天细胞增殖速度达到高峰，处于指数增长期；从第7天起细胞增殖速度又开始减慢，逐渐达到平台期。见图2。

  

图2 hBM-MSC的生长曲线

2.3 6组hBM-MSC活性比较 与对照组比较，0.004 mmol/L锌处理组和0.016 mmol/L锌处理组的细胞活性升高(P<0.05)，而0.256 mmol/L锌处理组的细胞活性降低(P<0.05)；0.001 mmol/L锌处理组和0.064 mmol/L锌处理组的细胞活性与对照组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

 

表2 6组hBM-MSC活性比较(x±s，%)

  

组别nhBM⁃MSC活性对照组5100．000．001mmol/L锌处理组5104．46±12．510．004mmol/L锌处理组5130．88±17．08∗0．016mmol/L锌处理组5148．06±22．94∗0．064mmol/L锌处理组5121．35±14．990．256mmol/L锌处理组539．03±8．94∗ F值19．661P值<0．001

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4 5组hBM-MSC成脂效率比较 随着锌浓度的增加，锌处理组油红O染色阳性的细胞数也增多，细胞中的脂滴明显大于且多于对照组，见图3。定量分析结果显示，各浓度锌处理组细胞的成脂分化率均高于对照组(均P<0.05)，0.064 mmol/L锌处理组的成脂分化率最高(P<0.05)，见表3。

  

图3 各组hBM-MSC成脂化情况(油红O染色，×200)

注：A、B、C、D、E分别为对照组、0.001 mmol/L锌处理组、0.004 mmol/L锌处理组、0.016 mmol/L锌处理组、0.064 mmol/L锌处理组

 

表3 5组hBM-MSC成脂效率比较(x±s，%)

  

组别nhBM⁃MSC成脂率对照组3100．000．001mmol/L锌处理组3150．60±1．46∗#0．004mmol/L锌处理组3201．60±3．46∗#0．016mmol/L锌处理组3209．85±3．46∗#0．064mmol/L锌处理组3227．03±8．79∗ F值185．380P值<0．001

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.064 mmol/L锌处理组比较，#P<0.05。

2.5 5组hBM-MSC成脂基因mRNA相对表达水平比较 0.001、0.004、0.016和0.064 mmol/L锌处理组hBM-MSC成脂基因PPAR-γ、C/EBPα和FABP4的mRNA表达水平均高于对照组(均P<0.05)，0.016 mmol/L和0.064 mmol/L锌处理组的表达水平高于其他浓度锌处理组(P<0.05)。见表4。

 

表4 5组hBM-MSC成脂基因相对表达水平比较(x±s，%)

  

组别nPPAR⁃γC/EBPαFABP4对照组3100．00100．00100．000．001mmol/L锌处理组3116．67±6．87∗#112．61±5．59∗#115．30±5．51∗#0．004mmol/L锌处理组3118．35±5．65∗#123．19±6．84∗#156．68±7．66∗#0．016mmol/L锌处理组3134．19±10．23∗138．70±3．00∗173．51±5．93∗0．064mmol/L锌处理组3145．43±7．98∗166．52±6．91∗180．47±14．73∗ F值16．41163．22752．759P值<0．001<0．001<0．001

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.016 mmol/L和0.064 mmol/L锌处理组比较，#P<0.05。

3 讨 论

脂肪细胞是成人骨髓中含量最多的细胞组分，具有多方面的病理生理功能。骨髓脂肪细胞参与机体的脂肪代谢和能量储存，并能通过分泌瘦素、脂联素等脂肪细胞因子调节周围细胞的增殖、分化、凋亡等生理活动[2]。此外，骨髓脂肪细胞也参与骨代谢：在高龄或骨质疏松、骨坏死等病理状态下，骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化增强，导致脂肪细胞增多，骨量减少[8]；此外，脂肪细胞在造血过程中作为支持细胞促进造血细胞的成熟发育[3]。但也有学者发现骨髓脂肪细胞对造血起负性调节作用，抑制骨髓脂肪细胞的生成有助于促进临床骨髓移植患者造血功能的恢复[4]。我们在前期研究中发现骨髓脂肪细胞可能在急性髓系白血病的化疗抵抗中发挥重要作用，与急性髓系白血病的预后相关[5-6]。

目前骨髓脂肪细胞的形态、表型和功能特征并未完全明确[9]。此外，骨髓脂肪细胞与白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等血液系统疾病的发病、预后等关系也需要更多的研究加以明确。目前骨髓脂肪细胞体外研究的障碍在于难以从体内获取足量的骨髓脂肪细胞。现主要用密度梯度离心法获取骨髓液中的漂浮脂肪细胞并用天花板培养法在体外纯化分离培养[10]，但所获取的细胞数量非常有限，而且无法在体外长期培养，因此难以利用体内原位的骨髓脂肪细胞进行体外实验研究。由于骨髓脂肪细胞主要来源于间充质干细胞，目前常用的方法是用密度梯度离心法从体内获取骨髓间充质干细胞，通过体外培养、扩增后诱导分化为脂肪细胞再用于实验研究。但在常用的二维培养系统(细胞培养板、培养皿)中，骨髓间充质干细胞的成脂率较低，成脂体系中混杂着大量未分化的间充质干细胞，对进一步的实验存在较大的干扰。因此，提高骨髓间充质干细胞体外成脂分化率非常重要。

本研究结果显示， 除0.256 mmol/L锌处理组的细胞活性降低外，锌在0.001～0.064 mmol/L浓度范围内有利于hBM-MSC的存活，且与对照组比较，0.004 mmol/L锌处理组和0.016 mmol/L锌处理组的细胞活性升高(P<0.05)，提示0.004、0.016 mmol/L锌浓度可以促进细胞增殖。在成脂诱导培养基中添加适宜浓度的锌能使更多的细胞发生成脂分化，细胞中的脂滴也更大、更多，定量分析结果显示，各浓度锌处理组细胞的成脂分化率均高于对照组(P<0.05)。这均表明适宜浓度的锌能有效促进hBM-MSC的增殖和成脂分化。

锌是人体的必需微量元素，具有多种调节功能，参与胰岛素的合成、分泌、信号转导等生理过程[13]。在1型和2型糖尿病动物模型中，锌能提高糖类和脂类的代谢水平，降低血糖水平，表现出高效的抗糖尿病作用。在分离培养的细胞中，锌能促进葡萄糖的转运、糖原和脂质的合成，抑制糖原异生和脂肪分解[14]。然而，锌胰岛素样作用的分子机制还未完全阐明。有学者发现，磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的激活是锌胰岛素样作用的潜在分子机制[13]。锌能作用于与葡萄糖摄取相关的胰岛素受体，诱导磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B的磷酸化，激活胰岛素信号级联反应，将葡萄糖转运蛋白从胞质液转移到细胞膜上，促进细胞对葡萄糖的摄取，并刺激葡萄糖代谢为二氧化碳、脂肪酸甘油酯和甘油酯甘油[13]。该磷酸化作用能被细胞松弛素和渥曼青霉素抑制，从而减弱锌诱导的葡萄糖转运[7，13]。此外，锌还能在缺乏葡萄糖的情况下抑制β肾上腺素能药物羟苄羟麻黄碱激活的脂肪分解作用[20]。锌对葡萄糖氧化和脂肪分解的作用能被细胞外的过氧化氢酶抑制，提示这些效应是过氧化氢生成的结果[15]。因此，锌对脂肪细胞的胰岛素样作用不仅是由锌对细胞内代谢的直接作用引起，还与过氧化氢生成的间接作用相关。因此，我们推测锌促进hBM-MSC成脂分化的作用与锌促进细胞葡萄糖的摄取和转运、脂质的合成及抑制脂肪分解、游离脂肪酸释放等效应有关。本研究结果显示，0.001、0.004、0.016和0.064 mmol/L锌处理组hBM-MSC成脂基因PPARγ、C/EBPα和FABP4的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)，即锌处理的hBM-MSC成脂分化相关基因PPAR-γ、C/EBPα和FABP4的表达也明显增强，这提示锌可能通过作用于这些成脂基因发挥其促进细胞成脂分化的作用，但这一推论有待于后续实验加以验证。

作为新时代背景下的技术革新，物联网技术的发展与应为为社会各个领域提供了崭新的发展契机。铁路运输作为我国运输体系的重要组成部分，货运业务的安全与效率提升一直以来都是影响社会发展的重要因素。铁路运输与物联网技术的融合过程中，摒弃了传统管理方式的一些不足，实现了新时代背景下管理方式的优化与创新。

分别选取2016年1—6月与2017年1—6月在新疆医科大学附属中医医院进行实习的中医专业本科生及研究生各228名作为研究对象，2016年1—6月实习学生未参加中医执业医师实践技能考试的培训（设为对照组，228名），2017年1—6月实习学生参加了中医执业医师实践技能考试的培训（设为观察组，228名）。对照组中，男136名，女92名，年龄为20～22岁，平均年龄为（19.2±0.9）岁；观察组中，男138名，女90名，年龄为19～21岁，平均年龄为（19.0±0.5）岁。两组实习学生的一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

在前脂肪细胞转化为成熟脂肪细胞的过程中，伴随着许多基因(脂肪酸合成酶、磷酸甘油脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸结合蛋白、葡萄糖转运体4、胰岛素受体等)的表达上调，促进葡萄糖的转运和利用及TG的合成和聚积[11]。此前有学者发现锌具有胰岛素样作用，可作用于胰岛素受体和胞内磷脂酰肌醇激酶，影响葡萄糖转运蛋白4摄取葡萄糖[7]。锌还能抑制脂肪细胞释放游离脂肪酸，并影响磷酸二酯酶的激活[12]。故此我们推测锌可能有利于间充质干细胞成脂分化过程中细胞对葡萄糖的转运和利用及脂质的合成和聚积，从而促进细胞成脂分化。

（1）无双重支付的情形。假设A有1枚比特币，要将其转给B。A首先构造一笔交易Tx1：使用私钥签署该笔交易，并将交易单Tx1广播出去。其他实体收到信息后，通过UTXO索引计算A是否有能力支付1枚比特币，如果有能力支付，则认为此次交易是合法。最后，A的钱包地址减少1枚比特币，B的钱包地址增加1枚比特币。

我们所使用的锌属于无机化合物，价格便宜，而且具有操作简便、使用安全、作用周期长的优点，因此更易于广泛应用。随着细胞三维培养的兴起和发展，目前可以将锌整合到生物学材料如生物活性陶瓷中制成缓释系统，在细胞培养和分化的过程中使锌自动、持续地释放到培养液中，维持培养液中稳定有效的锌浓度，大大简化了实验操作程序，而且可以适用于细胞分化的体内研究和临床应用，具有良好的应用前景。

综上所述，作为成脂诱导培养基的成分，锌在一定浓度范围内能显著促进hBM-MSC的成脂分化。但锌作为成脂诱导培养基的刺激因素对骨髓间充质干细胞的作用研究还处于初步阶段，需要更多的实验来验证这一结论。锌促进骨髓间充质干细胞成脂分化的具体机制也仍需深入研究加以阐明。此外，锌处理的间充质干细胞分化的脂肪细胞是否在形态、表型、功能特征上的变化也不清楚，需进一步研究探明。

参 考 文 献

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