肺癌是导致肿瘤相关死亡比例最高的一种恶性疾病[1]，考虑到精神病患者肿瘤发病率低于预期值，抗精神病药物可能对肿瘤有抑制作用[2]。实验发现，抗精神病药物主要通过抑制钙调素[3]，干扰细胞膜[4]和抑制Akt细胞通路[5]等抑制肿瘤细胞的发生发展。氯丙嗪对多种肿瘤具有抑制作用，如通过上调P53促进直肠癌细胞的凋亡[6，通过雌激素受体协同他莫昔芬对乳腺癌的抑制作用[7]；然而，氯丙嗪对肺腺癌细胞是否也具有抑制作用，目前尚无报道。

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本文拟探讨氯丙嗪对肺腺癌A549细胞是否具有抑制作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人种来源肺腺癌细胞A549细胞系(武汉大学中国培养物典藏中心)，RPMI1640培养基(HyClone公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，胰酶(杭州四季青)，双抗(杭州四季青)，PBS溶液(杭州四季青)，氯丙嗪(常州康普药业有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，sigma公司)，基质胶(Sigma公司)，凝胶制备试剂盒，转膜缓冲液，电泳缓冲液，DNA loading buffer，丽春红染色液，一、二抗稀释液，脱脂奶粉(塞维尔生物)，Transwell小室(Corning公司)。

1.2 细胞培养

将肺腺癌A549细胞常规培养于含10%胎牛血清和1%双抗的l640培养基中，置于37℃、5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，每隔1d换液一次，2～3d传代一次。

1.3 MTT实验

待肺腺癌A549细胞处于对数生长期时，细胞浓度调整为1×104个/mL，96孔板中每孔加200μL细胞悬液。待24h细胞贴壁后，更换含不同浓度的氯丙嗪培养液，200μL/孔，分7个实验组，每组6个平行复孔，药物浓度分别为0、10、20、40、60、80、100μmol/L。置于培养箱中培养48h后，每孔加0.5%MTT溶液20μL，继续培养4h，吸弃96孔板中的上清液，加入150μL/孔的二甲基亚砜溶液，将96孔板置于摇床上震荡10～15min，使用酶标仪测定在490nm处的吸光度。

1.4 平板克隆形成实验

目前肺腺癌的治疗主要为化疗，化疗是一种全身性治疗，缺乏靶向性及特异性，对所用生长周期短的细胞均有抑制作用，副作用较大，使得化疗被动减药或停止。现急需有新的有效药物治疗肿瘤疾病，但是新药开发时间长，成功率低且花费高，不能满足疾病增长态势，故将目光转向现有的临床药物，开发其新的用处即“老药新用”。现有药物其药理学、药代动力学、毒副作用等已研究透彻，新开发的用药途径可以迅速进入后期临床试验，缩短开发周期。如今越来越多的非肿瘤药物被发现具有抗肿瘤作用，如若将其研究清楚会使得肿瘤患者有更多的治疗选择。氯丙嗪自问世以来，其化学结构、药理作用等都已被研究透彻。作为第一代抗精神病药物，氯丙嗪不仅具有镇痛作用，并且可以阻断多巴胺D2受体，同时还可以产生α-肾上腺素能阻断作用，减少脑干网状结构上行激活功能从而起到镇静止吐作用。IC50是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。氯丙嗪对神经母细胞瘤的IC50为6～18μmol/L，是氯丙嗪治疗精神病患者脑中的IC50的1.2～3.6倍[15]。此外氯丙嗪的临床治疗剂量可促进白血病和淋巴瘤细胞的凋亡而不影响正常细胞[16]。可见氯丙嗪不仅可以抑制肿瘤疾病的发生发展，同时还可缓解化疗药物引起的副作用。目前氯丙嗪抗肿瘤作用在不断的被证实，故认为氯丙嗪可作为新一代抗癌药物用于肿瘤的治疗。

综上，在不同年龄发病及性别组的分析中，各组DCM患者临床特点有相似也有差异，这可能与基因、遗传、环境、代谢等因素相关，随着基因遗传学和分子生物学发展，学者们对该病的研究已在基因遗传领域有所收获。在与多项研究对比中，表明该病在不同人群、地区、民族之间，其发病特点有所不同。本研究首次对本地区的138例DCM患者的临床特征进行分析，较好代表本人群、地区、民族中DCM患者的发病及临床特点，但仍存在较多限制及不足，下一步我们应该扩大样本量、加强随访并收集心电图、肝肾功能等代谢指标，对于猝死病人，可通过心肌组织活检方式进一步明确病理类型，才能进一步充分体现本地区人群DCM患者临床特征。

1.5 Transwell迁移及侵袭实验

待肺腺癌A549细胞处于对数生长期时，加入含氯丙嗪培养基，药物浓度为0、5、10、20μmol/L，培养48h。24孔板中，将基质胶用无血清1640培养基1∶40稀释，每孔加入120μL，置于37℃培养箱中30min后水化基底膜继续放入培养箱中培养30min。取药物作用后的肺腺癌细胞，PBS洗2～3次，用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心，无血清1640培养基重悬细胞、混匀，细胞浓度调整为1×105个/mL。分别在上室加细胞悬液200μL/孔，下室加入500μL 10%完全培养基，常规培养24h，弃培养基，擦去上室基质胶，甲醇常温固定后结晶紫染色，清洗后晾干，每个小室取5个视野拍照、计数。迁移实验无需基质胶包被上室。

1.6 Western blot

待肺腺癌A549细胞处于对数生长期时，加入含氯丙嗪培养基，药物浓度为0、5、10、20μmol/L，培养48h。一抗1∶2000稀释，二抗1∶3000稀释进行Western blot实验。

1.7 统计学方法

使用Graphpad Prism 5.0软件进行数据处理。计量资料用平均值±标准差表示，计数资料用“率”表示，两组间均数比较使用students's t检验，多组间比较使用One-way ANOVA，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 氯丙嗪抑制肺腺癌A549细胞的生存及增殖

MTT实验结果显示(见图1)，与对照组比较，肺腺癌A549细胞的生存能力随着氯丙嗪浓度的递增，呈递减趋势(P<0.01)，在药物浓度达到40μmol/L时几乎无细胞存活；平板克隆形成实验结果显示(表1)，A549细胞的克隆形成能力随着药物浓度的增高而减弱，并且随着药物浓度的增加，单个细胞群落也减少。说明氯丙嗪对细胞的增殖能力和克隆能力有明显的抑制作用。

  

多组间比较，***P<0.01

 

图1 不同浓度氯丙嗪对A549细胞生存能力的影响

 

表1 不同浓度氯丙嗪对A549细胞克隆能力的影响

  

氯丙嗪浓度(μmol/L)051020克隆形成率(%)4．993±0．044．067±0．18∗0∗∗0∗∗

与对照组(氯丙嗪0μmol/L)比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 氯丙嗪抑制肺腺癌A549细胞的迁移与侵袭

Transwell迁移及侵袭实验结果显示(见图2、3，封二，表2)，与对照组比较，氯丙嗪对A549细胞迁移、侵袭能力有明显抑制作用(P均<0.05)，且随着药物浓度的增大，肺腺癌A549细胞的迁移、侵袭能力亦降低。

 

表2 不同浓度氯丙嗪对A549细胞迁移、侵袭能力的影响个)

  

项目0μmol/L5μmol/L10μmol/L20μmol/L侵袭细胞307．20±10．41173．20±7．43∗142．40±4．48∗70．20±8．56∗迁移细胞167．20±12．2973．50±1．50∗44．00±2．00∗15．33±4．67∗

与对照组(氯丙嗪0μmol/L)比较，*P<0.05

2.3 氯丙嗪下调肺腺癌A549细胞CaMKⅡ、c-Fos蛋白的表达

Western blot结果显示(见图4)，与对照组比较，氯丙嗪刺激后肺腺癌A549细胞CaMKⅡ、c-Fos蛋白的表达水平明显下调，且随着氯丙嗪浓度的升高，下调水平越显著。

  

图4 不同浓度氯丙嗪对A549细胞CaMKⅡ、c-Fos蛋白表达的影响

3 讨 论

在全球范围内，肺癌是导致肿瘤相关死亡比例最高的一种恶性疾病，其中多数为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)。肺腺癌属于NSCLC，目前NSCLC的首要化疗方案是含铂双药方案，如紫杉醇、培美曲塞、长春瑞滨等第3代化疗药联合铂类制剂为主。但化疗药物具有一定的毒副作用如抑制胃肠功能、骨髓造血功能，产生神经外周毒性和剂量相关性肌痛等。故需开发新的药物治疗肺癌。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是一种可通过钙/钙调蛋白(calmodulin，CaM)活化磷酸化的多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，而钙/钙调蛋白信号传导是细胞周期进程所必需的。CaMKⅡ在多种肿瘤中均有表达，抑制CaMKⅡ的活性诱导肿瘤细胞的细胞周期停滞。肺癌细胞中，CaM抑制剂KN-62可抑制Ca2+通过电压门控Ca2+通道流入胞内刺激CaMKⅡ的磷酸化，抑制DNA合成延缓S期的进展[8]。CaMKⅡ抑制剂KN-93可抑制CaMKⅡ使细胞周期停滞于G1期[9]。CaMKIV的表达抑制CaMKⅡ的自磷酸化和活化，并引起G0/G1细胞周期停滞，抑制细胞增殖[10]。c-Fos作为CaMKⅡ的一个下游通路，CaMKⅡ可以激活c-Fos基因转录[11]。在肺癌细胞中c-Fos的表达明显高于癌旁组织，并且c-Fos可导致上皮间质化，促进肿瘤转移[12]。因此，CaMKⅡ、c-Fos在肺癌的发生发展中可能是一个重要靶点。

[10]MONACO S,RUSCIANO M R,MAIONE A S,et al.A novel crosstalk between calcium/calmodulin kinases II and IV regulates cell proliferation in myeloid leukemia cells[J].Cell Signal，2015,27(2):204

铁路勘察设计院可利用自身丰富的项目资源，把工程建设项目作为锤炼总体的平台，有目的地选择一批德才兼备、专业技术水平突出、经历过以上系统培训的具有总体潜质的人才，配置在项目技术队长、专册、副总体等关键岗位，在项目推进中尽早识别和发现优秀的总体后备人选。

[8]WILLIAMS C L,PHELPS S H,PORTER R A.Expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase types II and IV,and reduced DNA synthesis due to the Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase inhibitor KN-62 (1-[N,O-bis(5-isoquinolinesulfonyl)-N-methyl-L-tyrosyl]-4-phenyl piperazine) in small cell lung carcinoma[J].Biochem Pharmacol,1996,51(5):707

待肺腺癌A549细胞处于对数生长期时，细胞浓度调整为1×103个/mL，6孔板中每孔加入2mL细胞悬液，待24h细胞贴壁后，弃培养液，PBS溶液清洗1～2遍，更换含不同浓度氯丙嗪的培养液2mL/孔，药物浓度分别为0、5、10、20μmol/L，常规培养12d，每3d换含药培养基一次，每次实验重复3次。常规培养12d后弃含药培养液，PBS溶液清洗，甲醇常温固定后结晶紫染色，清洗后晾干。

参考文献：

[1]FERLAY J,SOERJOMATARAM I,DIKSHIT R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide: sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359

[6]LEE W Y,LEE W T,CHENG C H,et al.Repositioning antipsychotic chlorpromazine for treating colorectal cancer by inhibiting sirtuin 1[J].Oncotarget,2015,6(29):27580

[3]HAIT W N,LEE G L.Characteristics of the cytotoxic effects of the phenothiazine class of calmodulin antagonists[J].Biochem Pharmacol,1985,34(22):3973

[4]WIKLUND E D,CATTS V S,CATTS S V,et al.Cytotoxic effects of antipsychotic drugs implicate cholesterol homeostasis as a novel chemotherapeutic target[J].Int J Cancer,2010,126(1):28

[5]CHOI J H,YANG Y R,LEE S K,et al.Potential inhibition of PDK1/Akt signaling by phenothiazines suppresses cancer cell proliferation and survival[J].Ann N Y Acad Sci,2008,1138:393

地表沉量测值是反映地面建筑物沉淀池不均匀沉降和构筑物安全、隧道结构安全和稳定的重要数据，对数据的及时反馈进行整理分析，判断发展变化的规律，有效指导注浆施工。

要激发孩子参与阅读活动的热情，家长主导下的亲子阅读必须是一个趣味十足且富有意义的活动。除了开展各种形式的阅读活动，家长还要引导孩子进行想象和创造，深入挖掘阅读材料的价值，使亲子阅读变得有趣、有价值、有意义。

[2]COHEN M,DEMBLING B,SCHORLING J.The association between schizophrenia and cancer:a population-based mortality study[J].Schizophr Res,2002,57(2-3):139

[7]YDE C W,CLAUSEN M P,BENNETZEN M V,et al.The antipsychotic drug chlorpromazine enhances the cytotoxic effect of tamoxifen in tamoxifen-sensitive and tamoxifen-resistant human breast cancer cells[J].Anticancer Drugs,2009,20(8):723

本实验通过MTT实验、平板克隆实验，肿瘤迁移、侵袭实验，Western blot实验等证明氯丙嗪对肺腺癌细胞A549细胞的恶性生物学行为抑制作用。随着氯丙嗪浓度的增加，肺癌细胞的发生发展均受到不同程度的影响。在药物浓度达到40μmol/L的时候，肺腺癌细胞丧失生存能力。肺腺癌细胞在药物浓度达20μmol/L的时候克隆形成能力则几乎消失。肺腺癌细胞随着药物浓度的增加其迁移、侵袭能力逐渐减低但并没有完全被抑制。Transwell迁移、侵袭实验反应了肿瘤细胞的转移能力，而肿瘤细胞的增殖早于转移，说明氯丙嗪在肺癌的发生发展过程中的早期起抗增殖作用。在Western blot实验当中，CaMKⅡ与c-Fos的表达随着氯丙嗪药物浓度的增高而降低。可见氯丙嗪通过CaMKⅡ与c-Fos影响肺腺癌A549细胞的细胞周期从而影响肿瘤增殖与迁移。这与前期他人研究氯丙嗪通过阻滞肿瘤细胞周期而抑制肿瘤增殖的结果相符[13]。

[9]MORRIS T A,DELORENZO R J,TOMBES R M.CaMK-Ⅱ inhibition reduces cyclin D1 levels and enhances the association of p27kip1 with Cdk2 to cause G1 arrest in NIH 3T3 cells[J].Exp Cell Res，1998,240(2):218

防洪薄弱环节建设加快实施。实施中小河流治理项目29项，治理河道79.56km。规划内73座病险水库除险加固已全面完工或主体完工56座，完工率为77%。完成了26个县山洪灾害防治非工程措施建设任务。

氯丙嗪属吩噻嗪类药物，对神经胶质瘤和神经母细胞瘤具有抗增殖作用，其机制可能与有丝分裂停滞有关。氯丙嗪是有丝分裂驱动蛋白KSP/Eg5的有效和特异性抑制剂，可通过有丝分裂阻滞和单极纺锤体积聚来抑制肿瘤细胞增殖，在HCT116细胞系中抑制有丝分裂驱动蛋白KSP/Eg5的活性从而抑制肿瘤细胞的增殖作用[13]。在大鼠C6胶质瘤中，氯丙嗪可通过Egr-1活化p21Waf1/Cip1基因调节细胞周期中G1期和G2/M期，使细胞在G2/M期周期停滞[14]。

2.2 公主岭霉素田间施用对水稻和其他非靶标生物的影响 试验期间各药剂处理区的水稻生长正常，抽穗和谷粒发育良好，未发现供试药剂对水稻产生药害现象，亦未发现对有益生物产生不良影响。

[11]MIRALEM T,TEMPLETON D M.Heparin inhibits Ca2+/calmodulin-dependent kinase II activation and c-Fos induction in mesangial cells[J].Biochem J,1998,330(Pt2):651

在军地院校和学术机构开展维和相关理论和政策的研究交流，对维和行动的模式和理论进行总结、提高和创新，结合实际情况和需要提出改进建议，包括资源的优化整合、人员的科学管理以及力量的快速投送等，以切实提高维和行动部署效率和行动效能。

[12]LIU C,DING L,BAI L,et al.Folate receptor alpha is associated with cervical carcinogenesis and regulates cervical cancer cells growth by activating ERK1/2/c-Fos/c-Jun[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,491(4):1083

[13]LEE M S,JOHANSEN L,ZHANG Y,et al.The novel combination of chlorpromazine and pentamidine exerts synergistic antiproliferative effects through dual mitotic action[J].Cancer Res，2007,67(23):11359

[14]SHIN S Y,KIM C G,KIM S H,et al.Chlorpromazine activates p21Waf1/Cip1 gene transcription via early growth response-1 (Egr-1) in C6 glioma cells[J].Exp Mol Med,2010,42(5):395

[15]WIKLUND E D,CATTS V S,CATTS S V,et al.Cytotoxic effects of antipsychotic drugs implicate cholesterol homeostasis as a novel chemotherapeutic target[J].Int J Cancer,2010,126(1):28

[16]ZHELEV Z,OHBA H,BAKALOVA R,et al.Phenothiazines suppress proliferation and induce apoptosis in cultured leukemic cells without any influence on the viability of normal lymphocytes.Phenothiazines and leukemia[J].Cancer Chemother Pharmacol,2004,53(3):267

大齿轮的齿形系数YFα=2.61，应力校正系数YSα=1.596；小齿轮的齿形系数YFα=2.19，应力校正系数YSα=1.783；分别对大小齿轮的(YFα·YSα)/[σF]进行计算，计算后小齿轮的(YFαYSα)/[σF]较大。