近年来，我国环境空气颗粒物污染日益严重，炭黑颗粒是大气颗粒物的核心组分，经呼吸道进入人体后可到达多个器官组织，除了可引起慢性支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌等呼吸系统疾病外，还可导致心血管及生殖系统等多系统脏器发生病变[1-3]。由于炭黑广泛存在于工作场所和生活环境中，且危害较大，目前越来越多的学者研究其对机体损伤的机制，一般采用吸入式染毒、非暴露式气管灌注和暴露式气管灌注等染毒模型进行整体动物试验研究[4-5]。吸入式染毒法是直接将动物头部或全身置于充满颗粒的染毒柜，使其主动吸入颗粒，虽然该方法与颗粒进入人体的方式很相似，能够控制染毒浓度，但难以估计动物体内的实际暴露水平，且该染毒装置价格昂贵[6]；非暴露式气管灌注虽然不会对动物造成直接损伤，但该方法灌注的成功率较低；而暴露式气管灌注法虽然有一定的皮肤创伤，但肉眼可以看见气管，准确度高，是一种较常用的染毒方法。目前多采用一次性暴露式气管灌注颗粒的动物实验模型进行毒性机制研究[7]，但对该染毒模型动物存活率的研究甚少，因此，本研究从不同灌注条件入手，探讨不同灌注浓度和体积对实验动物存活情况的影响，保证染毒动物模型的存活率，也为后期开展多次暴露式气管灌注颗粒染毒模型提供一定的参考依据。

将成模动物按体质量均衡和随机的原则分为5组：人参钩藤合用高、中、低剂量组及卡托普利组和模型组，包括假手术组在内，共计6组，每组9只。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材

1%戊巴比妥钠，医用酒精，无菌生理盐水，解剖板，眼科剪，眼科直镊，眼科弯镊，缝合线，1 mL注射器，脱脂棉球，玻璃平皿，2 mL平头针。

1.2 炭黑颗粒悬液的制备

根据染毒的浓度和体积，称取一定量的炭黑颗粒(Printex90，平均粒径14 nm，比表面积300m2/g，Degussa公司)，高压灭菌，加入一定体积的灭菌生理盐水制成炭黑颗粒混悬液，使用前低温超声15 min。

1.3 实验动物分组

SPF级雄性C57BL/6小鼠108只(6～8周龄，16～18 g)，由湖北省疾病预防控制中心提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2015-0018。饲养一周后，将小鼠随机分为生理盐水组、2.5、25 mg/mL炭黑染毒组，每组分3个亚组，采用一次性暴露式气管灌注法，分别灌注体积为0.05、0.10、0.15 mL的染毒溶液，每个亚组12只动物。

1.4 实验动物染毒

1.4.1 小鼠麻醉和固定

根据小鼠体重计算麻醉剂(1%戊巴比妥钠)的用量(8 μl/g体重)，腹腔注射麻醉小鼠。待小鼠身体颤抖并且比较剧烈时，固定小鼠四肢，并用细线套住上牙齿，使其颈部尽量伸展。

在上《大自然的文字》一课时，为了让学生体会作者伊琳“任何复杂生硬的科学原理在他笔下都变得津津有味”的语言特色，我选定文中介绍云的段落，然后寻找一段介绍云的说明性文字与原文对照阅读。对比之下，学生很容易就发现了伊琳善于运用比喻、拟人、形象描述等方法介绍事物。接着，要求仿照这样的语言特点，介绍一个事物。

1.4.2 小鼠灌注

用酒精棉球消毒颈部皮肤后，剪开甲状软骨下1 cm左右的皮肤，找到气管位置，用弯镊一次性分离气管两侧肌肉。左(右)手用眼科弯镊轻轻将小鼠舌头斜向上拉出，右(左)手将注射器前段的平头针轻轻地从舌下插入气管，针头尽量朝向小鼠的上颚，再慢慢将针头向下插入，同时观察已暴露在外的气管。将针头向上轻挑，能够观察到针头在气管内，说明插入成功，慢慢注入一定体积的炭黑颗粒悬浮液，再缓慢向气管内注入2 mL左右空气。灌注后缝合颈部皮肤，消毒后将小鼠放回笼中，记录灌注1 h后和24 h后小鼠的存活情况。

[5]常旭红，陈璐斯，杨天，等.气管滴注纳米二氧化钛对大鼠的亚急性肺毒性实验研究[J].东南大学学报(自然科学版)，2014，44(3)：616

1.5 肺组织的采集

将灌注24 h后存活的小鼠颈椎脱臼法处死，取出肺组织，用生理盐水润洗3次，肉眼观察肺组织内是否分布有炭黑颗粒，再将左肺组织置于4%多聚甲醛固定液中固定和保存。

1.6 病理组织形态学检查

取固定的肺组织进行石蜡包埋，5 μmol/L切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，于光学显微镜下观察肺组织的病理学改变，并拍照。

1.7 统计学方法

本研究采用SPSS 13.0 软件进行数据处理，组间均数比较采用随机区组方差分析，进一步进行组间两两比较时，采用 LSD-t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠的存活情况

由表1可知，生理盐水组和2.5 mg/mL炭黑颗粒组小鼠在灌注不同体积溶液1 h后均全部存活，25 mg/mL炭黑颗粒组小鼠在灌注体积达到0.15 mL时，其存活率下降至83.3%,不同组间存活率差异无统计学意义(P>0.05)。气管灌注24 h后，当灌注体积≤0.10 mL时，生理盐水组小鼠全部存活，当灌注体积达到0.15 mL时，生理盐水组小鼠存活率为83.3%。灌注体积为0.05 mL时，2.5 mg/mL炭黑颗粒组的小鼠全部存活，当灌注体积≥0.10 mL时，存活率下降至83.3%；当炭黑浓度为25 mg/mL时，随着灌注体积的增加，小鼠存活率逐渐下降，当灌注体积达到0.15 mL时，小鼠存活率仅为66.7%。灌注24 h后，25mg/mL炭黑颗粒组小鼠存活率明显低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；各组灌注体积为0.15mL时，小鼠存活率明显低于灌注体积为0.05mL时，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

 

表1 灌注存活率(%)

  

灌注体积(mL)分 组1h24h0(生理盐水)2．5250(生理盐水)2．5250．05100．00100．00100．00100．00100．0083．33∗0．10100．00100．00100．00100．0083．3383．33∗0．15100．00100．0083．3383．33#83．33#66．67∗#

灌注24 h后，与生理盐水组比较，*P<0.05；灌注24 h后，与0.05mL组比较，#P<0.05

2.2 气管灌注炭黑颗粒24 h后小鼠肺组织的改变

B超联合促甲状腺素与甲状腺球蛋白比值检查诊断甲状腺结节良恶性价值分析………………… 杜海燕 刘美快 黄督平 等（5）692

由图2(封二)可见，镜下观察生理盐水组小鼠肺组织结构正常，未见炎性细胞浸润。灌注不同体积的2.5 mg/mL炭黑颗粒的小鼠肺组织均出现了炎性细胞的浸润及充血，随着灌注体积的增加，小鼠肺组织内肺泡间隔沉积的炭黑颗粒逐渐增多，支气管壁和肺泡壁逐渐增厚；25 mg/mL炭黑颗粒染毒组小鼠肺组织内支气管壁增厚，沉积大量的聚集炭黑颗粒，随着灌注体积的增加，炭黑颗粒聚集越明显，且肺泡间隔及肺泡壁内出现较明显的充血及炎性细胞浸润。

3 讨 论

生活历史一片空白。没有信物，没有纪念，除了地图册中母亲的一张素描、一枚戒指和保存下来的少量照片。她只能在逐步建立的现实生活中添加未曾有过的存在，比如婚姻，以及孩子。

本研究结果表明，一次性气管灌注颗粒的浓度和体积对灌注后小鼠的存活情况均有较大影响，当一次性气管灌注炭黑颗粒的浓度为2.5 mg/mL，灌注体积为0.05 mL时，灌注1 h后和24 h后小鼠全部存活，但灌注体积≥0.10 mL，灌注24 h后小鼠的存活率略下降。若炭黑浓度达到25 mg/mL，体积为0.15 mL时，灌注1 h后和24 h后的小鼠存活率明显降低，且镜下观察发现在灌注24 h后肺组织内支气管壁沉积大量聚集的炭黑颗粒，我们推测可能是由于炭黑颗粒是纳米级的颗粒物，具有轻、细、小的特性，其比表面积大，表面吸附能力强，剂量过大容易聚集成团，吸附在支气管壁，影响气道的通气换气功能，导致小鼠窒息死亡。

[3]EMA M，HOUGAARD K S，KISHIMOTO A，et al.Reproductive and developmental toxicity of carbon-based nanomaterials：A literature review[J].Nanotoxicology，2016，10(4)：391

为了保证单次气管灌注实验小鼠的存活率，灌注动作要快、准、轻，尽量控制灌注的炭黑颗粒浓度在25 mg/mL以下，灌注体积在0.10 mL以下。当炭黑颗粒浓度为2.5 mg/mL，体积为0.05 mL时，经气管灌注24 h后的小鼠全部存活，且肉眼观察肺组织无明显的改变，提示在该剂量条件下，气管灌注炭黑颗粒对小鼠的存活情况及肺组织基本无明显物理性的损伤，为后期进行多次气管灌注炭黑颗粒的慢性毒性实验模型提供了有利的线索。

自1976年1月美国国会预算办公室发布第一份5年期预算报告开始，目前包括美国在内的所有OECD国家，均已在财政规划的基础上编制中长期预算，比如美国、挪威、英国、德国、澳大利亚等国家都发布了10至75年不等的财政预测报告。这说明现在主要发达国家非常注重运用长期财政经济规划，建立中长期预算框架，评估和防范财政风险。西方国家的实践也证明，编制中长期预算不但能较好地预防年度预算中的短视行为，还能提高公共资源的配置效益，财政宏观调控也能进一步优化。

[2]WANG R，TAO S，SHEN H，et al.Trend in global black carbon emissions from 1960 to 2007[J].Environmental Science & Technology，2014，48(12)：6780

本实验采用一次性暴露式气管灌注的方法可直接观察灌注针是否插入气管，且能准确控制灌注颗粒的剂量，保证了实验的科学性和可行性，提高了染毒动物模型的成功率。目前多数采用气管灌注染毒动物模型的颗粒浓度在0.02～10 mg/mL之间，体积在0.05～0.20 mL之间[8-11]。本研究的预实验结果发现，当炭黑颗粒悬液浓度>25 mg/mL时，炭黑颗粒不能与生理盐水充分接触混匀，因此本研究选择的炭黑颗粒浓度分别是2.5、25 mg/mL，同时通过预实验确定炭黑颗粒悬液的体积分别为0.05、0.10、0.15 mL。

[1]WANG X，CHEN R，MENG X，et al.Associations between fine particle，coarse particle，black carbon and hospital visits in a Chinese city[J].Sci Total Environ，2013，458-460:1

参考文献：

因此，为了提高灌注过程及灌注24h后小鼠的存活率，在操作过程中应该注意：①小鼠的最佳麻醉剂量应以腹腔注射1%戊巴比妥钠5min左右小鼠出现蜷缩并伴有剧烈颤抖为宜。②注意确定开始灌注的时间。通过观察，小鼠麻醉后一般经历三个明显阶段：蜷缩并伴有剧烈颤抖，浑身瘫软无力肌肉松弛且呼吸频率减慢，再次蜷缩并伴有剧烈颤抖。最好在第三个阶段开始灌注，此时小鼠自主呼吸的能力较强，且灌注后能够一直保持较强的自主呼吸能力，有效的降低小鼠窒息死亡的可能性。③手术器械及操作过程中严格无菌，暴露气管时，切口大小要适中(1 cm左右)，同时应避开血管以免切口出血，使暴露的气管视野清晰，减少小鼠感染的可能性。④灌注时平头针插入气管时动作要轻柔，避免将气管插破，同时平头针在气管中的持续时间不宜过长，防止小鼠窒息死亡。⑤当灌注颗粒悬液的体积较大时，可分几次灌注，每次灌注约0.05mL后再缓慢向气管内灌入2mL左右空气，有助于炭黑颗粒在肺中的扩散，避免小鼠因气管堵塞出现窒息死亡。

肉眼观察生理盐水组小鼠肺组织呈粉红色，表面光滑；仅当灌注的炭黑颗粒浓度为2.5 mg/mL，灌注体积为0.05 mL时，肺组织无明显改变，其他炭黑颗粒染毒组小鼠肺组织内均有散在分布的黑色颗粒，且出现不同程度的充血(见图1，封二)。

[4]MORIMOTO Y，OYABU T，HORIE M，et al.Pulmonary toxicity of printer toner following inhalation and intratracheal instillation[J].Inhalation Toxicology，2013，25(12)：679

其中:Xi为第i个景区的网络关注度;n为景区数量，本研究中,n=9．当Pi取值越接近于100%时,游客对该景区的旅游偏好程度越高．

[6]李园园，高峰，解秋艳，等.吸入染毒纳米级炭黑气溶胶致小鼠肺炎性损伤的研究[J].中华预防医学杂志，2014,48 (12)：1098

[7]SABER A T，JENSEN K A，JACOBSEN N R，et al.Inflammatory and genotoxic effects of nanoparticles designed for inclusion in paints and lacquers[J].Nanotoxicology，2012，6(5)：453

[8]TELLABATI A，FERNANDES V E，TEICHERT F，et al.Acute exposure of mice to high-dose ultrafine carbon black decreases susceptibility to pneumococcal pneumonia[J].Particle and Fibre Toxicology，2010，7:30

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2)浙江省的观光采摘节在年间分布上具有明显的淡、旺季之分，由此分析得出浙江省的观光采摘节庆在开发上具备了开发面广、重点突出的特征，提出应多借鉴宁波、绍兴的模式、注重桃、蜜梨这些果树资源的重点开发。

河北省具有北部燕山、西部太行山及中东部平原的地形地貌特征，矿产资源分布与开发利用也具有明显的差别与特点(表2)。