糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病[1]，目前人类生活水平提高，糖尿病发病率出现逐年增多的趋势[2]。糖尿病可诱发一系列并发症，包括心脏、血管、肾脏、神经、足部等部位发生病理性改变[3]，其中，糖尿病心肌病会改变心脏功能，会引起心肌缺血和心衰，最终发生患者死亡[4]。大量研究表明，心肌细胞糖脂代谢异常[5]、炎症[6]、氧化应激[7]、心肌细胞凋亡都会导致糖尿病心肌病的发生。本实验选择了PA刺激H9C2心肌细胞诱导心肌细胞损伤，模拟糖尿病心肌损伤中的脂毒性损伤模型，为糖尿病性心肌细胞损伤的防治提供基础。

在对混凝土进行拌比时，需要根据建筑工程所需的强度与设计要求，对水、水泥、砂石与添加剂进行合理的配置，并按照规定的添加顺序进行相应添加，以有序化开展混凝土配置工作。混凝土材料配置完成后，需要对混凝土的搅拌时间与温度进行严格控制，以使得混凝土能够保持良好的均匀性与密实度。在混凝土配置完成后，需要对混凝土的配合比例与质量进行相应检测，若误差值超过规定数值后，则需要采取相应措施进行改进处理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系

H9C2心肌细胞购自武汉大学细胞典藏中心。

1 250 mm2导线和1 660 mm2导线均为4层铝线结构，且导线直径接近。研制的SKLX100型卡线器夹嘴长度为350 mm，经过工程验证表明它可以满足使用工况要求。因此可以将1 250 mm2导线夹紧时的铝股塑性范围作为1 660 mm2导线铝股损伤判断参考。

1.1.3 主要设备

高糖DMEM培养基(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；MTT粉末(Gibco公司，美国)；棕榈酸(PA，Sigma公司，美国)；DAPI细胞核染液(武汉谷歌生物有限公司，武汉)；细胞活性氧ROS试剂盒(Thermo Scientific公司，美国)；Tunel试剂盒(Roche公司，美国)。

1.1.2 主要试剂

6.2 套袋 疏果后，果实直径达到1.5～2 cm时套袋，2周内完成，可结合疏果进行套袋。套袋按照自上而下、从内到外的顺序进行，以免碰掉果实；套袋时不要用手摸幼果，以免影响果实发育和商品性；袋口要扎紧。

超净工作台(苏州安泰公司)；CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)；HVE-50高压灭菌器(日本Hirayama公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus株式会社)；电子分析天平(德国Sartorius公司)；3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

H9C2心肌细胞培养在含10%胎牛血清和100U/mL双抗的高糖DMEM中，静置于37℃、5%CO2的条件下细胞培养箱中孵育24h，细胞充分贴壁生长融合至80%时用含0.25% EDTA胰酶进行消化传代培养，取对数生长期的细胞进行本次实验。

这里Q(x,t),u(x,t),y(x,t)∈R分别是系统状态、控制输入、输出；b,c为不确定常数, 满足0<α1≤b≤α2, 0<β1≤c≤β2，其中α1,α2,β1,β2是已知常数. 输出y(x,t)表达式中不含有控制输入u(x,t)，即系统输入、输出无直输通道. 对式(1)给出如下假设条件：

1.2.2 PA的配制

准备EP管装有1mL无水乙醇，用分析天平精准称取PA粉末25.642mg，把称好的PA粉末倒入无水乙醇中，将EP管放入37℃水浴锅中轻摇震荡至完全溶解。然后使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，过滤后的储存液浓度为100mmol/L，使用前用37℃水浴锅将PA储存液完全溶解至无沉淀物方可使用。给药时，用含有5% BSA的DMEM稀释使用。

PA浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mmol/L，刺激时间设定为24h时它们的增殖率为101.4%、106.6%、102.2%、106.6%、71.7%和54.0%。PA 0.4mmol/L时细胞增殖出现明显下降,与control组比较，有极显著性差异(P<0.01)。PA 0.025mmol/L时细胞增殖并未受到明显抑制，PA 0.8mmol/L时细胞增殖率受到过度抑制。见图1。

不同浓度PA刺激H9C2心肌细胞的增殖情况：正常对照组(control)，含0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L PA的高糖DMEM培养24h；0.4mmol/L PA刺激H9C2心肌细胞不同时间的细胞增殖情况：正常对照组(control)、含0.4mmol/L PA的高糖DMEM培养12h、24h、48h。 不同浓度高脂刺激对细胞形态学的影响：正常对照组(control)，含0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L PA的高糖DMEM培养24h后采用ROS与Tunel试剂盒进行检测。

1.3 检测指标

1.3.1 MTT比色法检测H9C2心肌细胞增殖率

在96孔板中接种H9C2心肌细胞悬液(每孔1×106细胞，每孔100μL)，每组设置6个复孔。将96孔板放回细胞培养箱中培养24h待细胞完全贴壁，向每孔加入不同浓度含PA的培养基继续培养相应时间。弃去孔内所有上清液，向每孔加入20μL 0.5%MTT溶液放回细胞培养箱继续培养4h，用酶标仪读取在570nm处的吸光度值。

1.3.2 化学荧光法检测细胞活性氧ROS

[5]HOU J,ZHENG D,FUNG G,et al.Mangiferin suppressed advanced glycation end products (AGEs) through NF-κB deactivation and displayed anti-inflammatory effects in streptozotocin and high fat diet-diabetic cardiomyopathy rats[J].Can J Physiol Pharmacol,2016,94(3):332

1.3.3 Tunel法检测细胞凋亡情况

STEM教育从根本上想要培养适应社会、思维活跃的创新型人才，因此，在教学过程中通过实际问题及情境的设置，帮助学生更早地接触到专业性的活动，启发学生找到职业兴趣所在，进而进行职业规划。在教学活动中建构在社会中可能遇到的问题，使得学生较早地意识到自身未来的社会价值，自主探索专业知识的同时，培养创新思维，提升职业素养。

在制定还管理制度以后，为了避免员工执行的问题，使经济管理达成应有的效果，企业还要加强内部监督，建立完善科学的监督机制。这种监督机制不要求一成不变，而要求根据经济管理模式的情况来进行完善与调节。另外，企业还要根据市场营销的模式发展情况，采取适当的企业的经济管理监督措施，发挥监督机制的经济管理职能。

综上所述，H9C2心肌细胞给予高脂刺激能够抑制细胞的增殖，并且会导致细胞内活性氧的增加，从而促进细胞出现凋亡。当PA浓度设为0.4mmol/L，刺激时间设为24h时，能够成功建立心肌细胞脂毒性损伤模型。

1.4 统计学方法

本实验数据均使用GraphPad Prism7软件处理，两组数据间差异采用t检验进行计算，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 高脂刺激对H9C2心肌细胞增殖率的影响

1.2.3 实验分组

  

图1 不同浓度的PA刺激24h细胞增殖情况(n=6)

与control组比较，PA浓度为0.2mmol/L时，细胞ROS水平有所增加，细胞出现轻微形态学改变(如细胞体积缩小、连接减少、细胞质密度增加、核质浓缩、核膜核仁破碎)。当0.4mmol/L PA刺激H9C2心肌细胞24h时，细胞数量急剧减少，细胞质与细胞核均发生不同的改变，显示为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢等现象。见图3(封二)。

  

图2 PA浓度为0.4mmol/L不同时间细胞增殖情况(n=6)

所以，综合两组MTT数据，在接下来的试剂盒检测中分组均以0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L PA刺激H9C2心肌细胞24h作为高脂刺激条件。

2.2 高脂刺激对H9C2心肌细胞ROS水平的影响

设置PA浓度为0.4mmol/L时，12h、24h和48h的细胞增殖率分别为74.0%、50.0%和26.4%，与control组比较，有极显著性差异(P<0.01)，在12h时细胞增殖率受到抑制不足50%，48h时细胞增殖率受到过度抑制。见图2。

2.3 高脂刺激对H9C2心肌细胞凋亡情况

当0.2mmol/L PA刺激H9C2心肌细胞24h时，Tunel标记的红色荧光有所增强，细胞出现轻微细胞学形态改变(如细胞体积缩小、连接减少、核质浓缩、核膜核仁破碎)。当0.4mmol/L PA刺激H9C2心肌细胞24h时，Tunel标记的红色荧光显著增强，但细胞数目出现明显减少，细胞质与细胞核均发生明显的细胞凋亡相关形态学改变(如核固缩、核碎裂、胞膜破裂，细胞内容物外溢等)。见图4(封二)。

3 讨 论

持续处于高糖高脂环境对糖尿病的发生发展有着至关重要的作用[8]。越来越多研究表明脂毒性能够诱导H9C2心肌细胞的凋亡，导致心脏功能受损[9]。脂毒性也会促使血管、肾脏、神经、足部等部位发生病理性改变[10]。心肌细胞能量代谢主要是游离性脂肪酸，当高脂诱导的心肌细胞损伤出现能量代谢紊乱时，会使得心肌细胞对游离脂肪酸的需要量增加，导致心肌细胞会出现一系列不良反应[11]。细胞长时间处于高脂环境中会促使氧化应激的发生，导致心肌细胞氧化与抗氧化功能失调，最终诱导心肌细胞的凋亡[12]。

高脂环境持续刺激机体时，机体自身的活性氧(ROS)会产生的越来越多并且不能及时有效地清除，会使细胞氧化与抗氧化功能打破正常工作状态，产生氧化应激损伤。本研究中，当PA浓度为0.2mmol/L时与正常对照组比较，细胞活性氧有所增加，而且细胞开始出现凋亡相关形态学改变；当PA浓度为0.4mmol/L时细胞数量急剧减少，细胞发生明显的凋亡。这说明，长时间暴露于高脂环境下，可使心肌细胞发生氧化应激损伤，导致细胞的形态和数目发生改变，最终导致心肌细胞出现凋亡[13]，影响心脏的正常功能。同时，我们通过Tunel试剂盒也检测到，随着PA浓度的增加，H9C2心肌细胞逐渐出现凋亡相关改变。当PA浓度增加为0.4mmol/L时，Tunel标记的红色荧光明显增强，同时细胞数量明显减少，细胞失去正常形态，呈现明显的凋亡相关形态学变化。

在24孔板中接种H9C2心肌细胞，向每孔分别加入不同浓度含PA的高糖DMEM培养基继续培养24h，弃去孔内培养基1×PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室温固定1h，3%过氧化氢封闭10min，0.1% Triton X-100渗透孵育2min，1×PBS清洗2遍后每孔加入50μL Tunel检测试剂，放回细胞培养箱培养1h。用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI细胞核染液，避光室温静置10min，1×PBS清洗2遍后收集细胞爬片，用抗荧光淬灭封片剂封片。在倒置荧光显微镜20倍镜下观察，拍照并将两种荧光图片进行组合。

临床教学管理体制并不健全，绝大多数科室对临床带教老师资格认定也没有明确规定，缺少对教学质量的考核。带教老师不重视知识的更新，对护生教学效果不够重视，教学质量无法保证。

参考文献：

为了改善包括人畜饮水在内的牧区水利建设中提水方式，顺应草原生态建设和低碳经济发展的需要，人们开始利用风能、太阳能等自然能源，通过能量转换装置来提取地下水。因为远离电网的牧区，季节性用水需求与风能资源和太阳能资源具有极好的相关匹配性。

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1）少部分学生参与任务的积极性不高。经过与这些同学沟通，发现问题的根源在于他们对英语缺乏学习兴趣，在中学阶段把主要精力放在了音乐专业知识的学习上，基本放弃了英语或其他课程的学习。“任务型教学模式”虽然不同于传统的教学模式，提高了课堂的趣味性，但对于这部分学生来说，还不足以使其发生太大的变化。对此，教师因适当设计一些容易完成且符合其专业特点的任务 （如英文歌曲演唱、电影配音等），让这些学生在参与任务的过程中不断增加自信心。教师应多进行正面引导，从而激发学生的学习热情和学习动力，取得良好的课堂教学效果。

[2]VIJAYAKUMAR S,VADUGANATHAN M,BUTLER J.Glucose-lowering therapies and heart failure in type 2 diabetes mellitus:mechanistic links,clinical data,and future directions[J].Circulation,2018,137(10):1060

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在24孔板中接种H9C2心肌细胞，向每孔分别加入不同浓度含PA的高糖DMEM培养基继续培养24h，弃去孔内培养基用不含胎牛血清的DMEM清洗2遍，按1∶500的比例用不含胎牛血清的DMEM配制ROS试剂盒试剂，每孔加入500μL配制好的试剂放回细胞培养箱中培养20min，弃去孔内培养基用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI细胞核染液，避光室温静置10min，1×PBS清洗2遍后收集细胞爬片，用抗荧光淬灭封片剂封片。在倒置荧光显微镜20倍镜下观察，拍照并将两种荧光图片进行组合。

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对于混凝土构件，受拉力作用时是最不利的，因为混凝土抗压强度很高，抗拉强度很低，配筋混凝土在受到拉力时极易产生裂缝，GB 50077—2017《钢筋混凝土筒仓设计规范》对裂缝的要求比较严格，为0.2mm，因此，当收到的拉力越大，构件中钢筋用于“抗裂”的占比越大，结构就越不经济。

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积极拓宽渠道，打造多元、稳定的业务及市场链条。石羊河流域行业取耗水总量控制与地下水超采区管理方案研究、甘肃省水利水电工程计价依据修编主要问题研究，均获甘肃省水利科技进步奖一等奖。宁夏盐环定扬黄工程受水区城乡水务一体化方案及工程水价测算有关成果被地方政府采用。开展广东省现代水利发展战略、引汉济渭水权置换、南水北调东中线一期工程两部制水价、西藏水生态补偿实施方案、引黄入晋供水管理体制、广西病险水库综合效益拓展等项目研究，取得了良好的社会、经济和生态效益，得到充分肯定和欢迎。

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