FAT4是钙黏蛋白家族的成员，是在果蝇中发现的候选肿瘤抑制基因。Qi等[1]首先提出FAT4在乳腺肿瘤中是一个重要的抑癌基因。Zang 等[2]报道，在复发性胃癌外显子测序中发现，FAT4可能是导致胃癌复发转移的一个重要抑癌基因，并在细胞水平证实了FAT4低表达可以促进胃癌细胞的侵袭、转移。本研究检测了FAT4在胃癌组织中的表达水平，并观察其与胃癌临床病理因素和远期生存的相关性。

当前我国在工程建筑方面监督机制不健全，主要是根据监理计量的现场管理以及决算的后期审查进行操作，在施工的过程中，后期的审计工作也只是根据前期的监理签字资料和施工设计图纸进行核算，导致在现场施工的过程中出现一些违规行为。

对象与方法

一、对象

2005年6月～2012年12月在我院收治手术的胃癌病人160例，其中男性120例，女性40例，平均年龄60岁，采集组织样本并用福尔马林固定石蜡包埋；2013年1月～2014年8月我院手术的胃癌病人30例，其中男性22例，女性8例，平均年龄62岁，采集原发性胃癌组织和成对的相邻非癌组织(距原发部位>5～10 cm)，并储存在液氮中直到使用。所有病人手术均为同一组医生完成，手术方式为胃癌D2根治术，近端胃癌行全胃切除，远端行远端胃切除。所有病人均签署知情同意书，研究方案经过我院伦理道德委员会批准。

石蜡包埋组织标本的纳入标准：2005年6月～2012年12月我院收治并行胃癌D2根治满5年的病人，有详细的临床资料和预后资料。排除标准：术后病理学诊断含有鳞癌、间质瘤等成分；术前接受过新辅助治疗。

冰冻标本的纳入标准：2013年1月～2014年8月我院收治并行胃癌D2根治手术的病人，术后留取冰冻癌组织和配对癌旁正常组织标本，术后病理诊断明确为胃腺癌(高分化腺癌2例，中分化腺癌11例，低分化腺癌12例，其他5例)。排除标准：术后病理学诊断含有鳞癌、间质瘤等成分；术前接受过新辅助治疗；标本留取不符合标准；标本储存过程中有过冻融。

二、方法

式中：Dx、Dy分别为泥沙扩散系数沿x、y方向的取值；s为含沙量；Fs为底部冲刷函数，采用切应力理论表达式如下：

2.免疫组化分析：将福尔马林固定的石蜡包埋胃组织标本切成4 μm厚的切片用于免疫组织化学染色。将切片与兔多克隆抗FAT4抗体(1∶150美国Novus Biologicals公司)在4℃下温度过夜，用PBS洗涤，并与生物素化的二抗(英国Abcam公司)孵育30分钟。用3，3′-二氨基联苯胺(DAB，武汉博士德生物工程有限公司)显现过氧化物酶反应性，并用苏木精复染色(HE)。采用染色强度评分和阳性细胞数评分的综合方法进行计分[3]。免疫组织化学(IHC)强度记为0(无染色)、1(弱染色)、2(中等染色)或3(强染色)，阳性细胞的百分比评分为0(阴性)、1(<10%)、2(10～50%)或3(>50%)，将IHC强度的得分乘以阳性细胞的百分比获得最终得分。最终得分≤1认为是阴性，最终得分为2～9认为是阳性。

应用SPSS 17.0软件对数据分析，计量资料以均数±标准差表示，应用Mann-whitney U-检验分析配对的肿瘤和正常组织中FAT4mRNA表达水平的差异。应用χ2检验来确定FAT4表达和临床病理学参数之间的联系。应用Kaplan-Meier分析和对数秩检验来评估5年存活率并比较存活曲线差异。P<0.05为差异有统计学意义。

1.RNA分离和定量RT-PCR：使用Trizol提取来自组织样品的总RNA。使用Prime Script RT试剂盒(TaKaRa，中国大连)进行定量RT-PCR。PCR引物为：FAT4正义链5′-TTGAAGGAAGGAGAACCCAT-3′和反义链5′-TGGTCCAATAGTAAAGAGGC-3′；β-actin正义链5′TTCYTACAATGAGCTGCGTGTG-3′和反义链5′GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

精神分裂症患者接受护理度额时候,需要对患者提供人文化的护理服务,根据患者的情况来选择合理的护理内容,流程化,规范化,降低医疗成本,提升护理效果。临床护理路径使用后能够有效的提供护理,对传统护理的不足进行了弥补。

三、统计学处理

3.蛋白印迹试验分析：使用RIPA裂解缓冲液从肿瘤标本制备裂解物(上海Beyotime公司)，通过离心澄清，并保存上清液直到分析。使用NE-PER核提取试剂盒(美国Pierce公司)制备核提取物。使用BCA蛋白测定试剂盒(美国Pierce公司)测定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE在5%或10%聚丙烯酰胺凝胶上分离30 μg蛋白质，并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜。室温下在Tris-缓冲盐水/吐温-20缓冲液(TBST)的5%脱脂奶中封闭2小时或在4℃过夜后，将膜与1∶1000一抗(美国Sanfa Cruz公司)在室温下孵育2小时或在4℃过夜。抗β-actin和GAPDH的抗体(美国Sanfa Cruz公司)作内部对照。在TBST中洗涤3次后，将膜与相应的辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(上海华舜公司)在室温下孵育1小时，再用TBST洗膜5次，每次10 min，并使用ECL Western blotting检测试剂盒(美国Pierce公司)显影。

结 果

通过RT-PCR方法检测了30例新鲜胃癌组织及其配对癌旁组织的FAT4mRNA表达水平， FAT4在胃癌组织下调13例(43.3%，13/30，图1A)，胃癌组织中FAT4mRNA表达水平显著低于癌旁组织P<0.05。采用Westernblot在蛋白水平检测FAT4表达，胃癌组织中FAT4蛋白含量显著低于癌旁组织(图1B)。免疫组织化学在正常组织中显示强的FAT4染色，在肠和弥漫性病理变化的肿瘤组织中显示出低的或不可检测的染色(图1C)，因标本例数少，而且随访时间不足2年，未统计病理因素与生存率的相关性。160例病人的经福尔林固定石蜡包埋的胃癌标品的免疫组化FAT4表达下调，160例胃癌组织中122例FAT4表达为阴性(76.25%)，主要在细胞核和细胞浆中表达；FAT4阴性表达与淋巴结浸润和生存率显著相关(P<0.05)(表1)。Kaplan-Meier法和对数秩检验用于检测FAT4表达与存活的相关性，表明FAT4阴性表达的总体生存率差显著相关(P<0.05)(图1D)。

 

 

 

 

 

A.FAT4 mRNA在30例胃癌组织及癌旁组织中的表达水平相对可标准化为β-actin的表达并通过2-△△ct的方法进行计算;B.胃癌样本组织和配对的癌旁组织中FAT4蛋白表达水平，P<0.05，采用Mann-Whitney U检验;C.胃癌组织中的FAT4的免疫组化染色，原始放大×200、×400，bar=100 μm;D.160例胃癌病人的Kaplan-Meier生存分析

 

图1 FAT4在胃癌组织中的表达

 

表1 FAT4蛋白表达与胃癌临床病理特征及5年总体生存率的相关性

  

百分比(%)FAT4阴性阳性P值例数12238性别0．054 男120(75．0)9624 女40(25．0)2614年龄(岁)0．213 <6087(54．4)6324 ≥6073(45．6)5914肿瘤大小(cm)0．337 ≥574(46．2)5915 <586(53．8)6323分化程度0．083 高分化4(2．5)40 中分化54(33．7)3519 低分化62(38．8)5012 其他40(25．0)337劳伦分型0．05 肠型60(37．5)4020 弥漫型94(58．7)7618 混合型6(3．8)60TNM分期0．098 Ⅰ17(10．6)107 Ⅱ67(41．9)4819 Ⅲ63(39．4)5310 Ⅳ13(8．1)112淋巴结转移0．000 有99(61．9)8514 无61(38．1)3724肝转移0．205 有5(3．1)50 无155(96．9)11738T分级0．229 T19(5．6)72 T210(6．2)55 T392(57．5)7319 T449(30．6)37125年总体存活率0．017 生存70(43．8)4723 死亡90(56．2)7515

讨 论

FAT钙黏蛋白家族是由32～34次重复钙黏蛋白组成的单次跨膜受体蛋白。从果蝇到脊椎动物，FAT家族成员结构相似。FAT钙黏蛋白家族成员有着相似的细胞外结构，但是它们在细胞内胞浆区的结构不同。这些不同的胞浆内结构反映了每一个FAT钙黏蛋白家族成员的独特功能[4]。FAT1是FAT家族目前研究最多的成员，其在调控细胞迁移、细胞极性、细胞间黏附、神经元功能等方面起到重要作用[5-7]。在很多种疾病中都发现了FAT1的表达下调，这其中就包括恶性肿瘤[8]；但是FAT1在恶性肿瘤中的表达不完全一致，在口腔癌和侵袭性乳腺癌的病例中都发现FAT1的下调，并且在其中的一些病例中发现了其基因的杂合性缺失，但是在结肠癌、小肠癌、肺癌、黑色素瘤和白血病中，均发现FAT1水平的上调[7，9-10]；FAT1在不同研究中表现为癌基因和抑癌基因的不同功能。FAT4是所有脊椎动物FAT家族中与果蝇FAT蛋白序列最相似的成员，目前已有的研究提示FAT4与多种恶性肿瘤存在相关性[11-12]。Wu等[13]研究表明，下调FAT4表达可以促进内皮细胞的运动和转移，提示FAT4可能在癌细胞的迁移和转移中具有重要作用。同时，Bossuyt等[14]报道，FAT4作为一个细胞黏附性蛋白影响细胞的迁移运动。这些研究提示FAT4可能作为癌细胞侵袭转移的抑制因子起作用。由于国际上对FAT4的研究较晚，目前的研究结果多局限于发现其与某种肿瘤的相关性，在这些研究中FAT4均表现为抑癌基因[1-2，15]。Zang等[2]报道，在复发胃癌外显子测序中发现FAT4可能是导致胃癌复发和转移的一个重要的抑癌基因，并在细胞水平证实了FAT4低表达可以促进胃癌细胞的侵袭转移。我们观察了160例胃癌标本中的FAT4的表达水平，其中122例表达为阴性。对30例胃癌及配对癌旁组织FAT4mRNA的表达水平分析，胃癌组织中FAT4mRNA表达水平显著低于癌旁组织。经Westernblot检测FAT4表达显示，胃癌组织中的FAT4蛋白含量显著低于癌旁组织，说明FAT4在胃癌组织中下调，FAT4在体内发挥着抑制肿瘤的作用，是抑癌基因。

由于胃癌有着早期发生淋巴结转移和远处转移的特征，造成其普遍存在着较差的预后[16]。胃癌中Wnt通路的活化已经得到了广泛的证实，很多影响肿瘤侵袭和转移的基因都是Wnt信号通路的靶基因，其中就包括基质蛋白酶MMP-16、MMP-14[17]。通过改变细胞外基质使自身更容易运动，这种特征是肿瘤侵袭的基础[18]。有研究发现，FAT4是导致胃癌复发转移的一个重要的抑癌基因，证明了胃癌组织FAT4低表达可以促进肿瘤生长、转移[2]，而肿瘤的生长转移又直接影响远期生存率。我们将160例胃癌组织标本和临床资料进行了观察分析，将FAT4表达阴性和阳性分为二组，观察FAT4表达与胃癌临床病理特征的相关性，结果显示，FAT4的低表达与肿瘤的大小、分化程度、TNM分期、肝转移、T分期没有相关性，与淋巴转移和存活率相关。在160例胃癌病人5年以上远期生存资料的统计结果中显示，FAT4的低表达远期生存率低、预后较差，差异有统计学意义。因此，检测胃癌FAT4表达对预测病人预后指导术后治疗有临床意义。

参考文献

[1] Qi C，Zhu YT，Hu L，et al.Identification of Fat4 as a candida tetumor suppressor gene in breast cancers[J].Int J Cancer，2009，124(4)：793-798.

[2] Zang ZJ，Cutcutache I，Poon SL，et al.Exome sequencing of gastric adenocarcinoma identifies recurrent somaticmutations in cell adhesion and chromatin remodeling genes[J].Nat Genet，2012，44(5)：570-574.

[3] Kusinska RU，Kordek R，Pluciennik E，et al.Does vimentin help to delineate the so-called ‘basal type breast cancer’[J]?J Exp Cli Cancer Res，2009，28：118.

[4] Saburi S，Hester I，Goodrich L，et al.Functional interactions between Fat family cadherins in tissue morphogenesis and planar polarity[J].Development，2012，139(10)：1806-1820.

[5] Moeller MJ，Soofi A，Braun GS，et al.Protocadherin FAT1 binds Ena/VASP proteins and is necessary for actin dynamics and cell polarization[J].EMBO J，2014，23(19)：3769-3779.

[6] Hou R，Sibinga NE.Atrophin proteins interact with the Fat1 cadherin and regulate migration and orientation in vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem，2009，284(11)：6955-6965.

[7] Skouloudaki K，Puetz M，Simons M，et al.Scribble participates in Hippo signaling and is required for normal zebrafish pronephros development[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(21)：8579-8584.

[8] Sadeqzadeh E，de Bock CE，Thorne RF.Sleeping giants：emerging roles for the fat cadherins in health and disease[J].Med Res Rev，2014，34(1)：190-221.

[9] De Bock CE，Ardjmand A，Molloy TJ，et al.The Fat1 cadherin is overexpressed and an independent prognostic factor for survival in paired diagnosis-relapse samples of precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia，2012，26(5)：918-926.

[10] Lee S，Stewart S，Nagtegaal I，et al.Differentially expressed genes regulating the progression of ductal carcinoma in situ to invasive breast cancer[J].Cancer Res，2012，72(17)：4574-4586.

[11] Li M，Zhao H，Zhang X，et al.Inactivating mutations of the chromatin remodeling gene ARID2 in hepatocellular carcinoma[J].Nat Genet，2011，43(9)：828-829.

[12] Agrawal N，Frederick MJ，Pickering CR，et al.Exome sequencing of hesd and neck squamous cell carcinoma reveals inactivating mutations inNOTCHI[J].Science，2011，333(6046)：1154-1157.

[13] Wu YH，Hu TF，Chen YC，et al.The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility[J].Blood，2011，118(10)：2896-2905.

[14] Bossuyt W，Chen CL，Chen Q，et al.An evolutionary shift in the regulation of the Hippo pathway between mice and flies[J].Oncogene，2014，33(10)：1218-1228.

[15] Rauch TA，Wang Z，Wu X，et al.DNA methylation biomarkers for lung cancer[J].Tumour Biol，2012，33(2)：287-296.

[16] Tao J，Calvisi DF，Ranganathan S，et al.Actication of bctacatenin and Tapl in human hepatoblastoma and induction of hepatocarcinogenesis in mice[J].Gastroenterology，2014，147(3)：690-701

[17] Lowy AM，Clementa WM，Bishop J，et al.Beta-Catenin/Wnt signaling in gastrointestinal expression of the membrane type 3 matrix metalloproteinase in gastric cancer[J].Cancer Res，2006，66(9)：4734-4741.

[18] Fanelli MF，Chinen LT，Begnami MD，et al.The influence of transforming growth factor-alpha，cyclooxygenase-2，matrix metalloproteinase(MMP)-7，MMP-9 and CXCR4 proteins involved in epithelial-mesenchymal transition on overall survival of patients with gastric cancer[J].Histopathology，2012，61(2)：153-161.