结直肠癌是消化系统中常见的恶性肿瘤，发病率居恶性肿瘤的第3位[1]，严重威胁人类的健康。目前，手术辅助放、化疗是治疗癌症的主要方法，副作用明显且给患者造成痛苦。根据癌症的发生、发展机制找出一种副作用小、价格低廉的药物来治疗结直肠癌显得尤为重要。地高辛是一种强心苷类药物，可以在缺氧环境中有效下调缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达[2-3]，从而抑制癌细胞的上皮间质化（epithelial-mesenchymal transition EMT）和迁移能力[4]，临床应用前景广泛。

目前地高辛（digoxin）对肿瘤治疗效果的研究主要集中在乳腺癌、肺癌和前列腺癌等[5-6]，而对结直肠癌的治疗研究相对较少。在地高辛作用于肿瘤细胞的研究中，HIF-1α是一个重要靶点，它对肿瘤的发现及治疗起关键作用。细胞对缺氧的反应通常由缺氧诱导因子转录因子家族调控[7]。在正常氧环境下，HIFα作为一种蛋白酶会自动降解，这是 von Hippel-Lindau（vHL）肿瘤抑制基因产物泛素化的结果[8]。而在缺氧条件下，HIFα和vHL之间的相互作用被消除，HIFα亚基是稳定的，进而允许其与HIFβ二聚化[9]，随后与低氧应激启动子中的低氧应答元件（HREs）结合[10]。以这种方式转录数百个下游基因以调节细胞存活、运动、代谢和血管生成，以恢复氧稳态。地高辛可在肿瘤发生过度生长时，调节HIF-1α的活性，降低肿瘤细胞EMT和迁移能力。

本文旨在探究地高辛对结直肠癌细胞的作用，通过比较RNA干扰敲除HIF-1α后的肿瘤细胞与地高辛处理的肿瘤细胞的EMT和细胞迁移能力，探讨地高辛对HIF-1α的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

HCT116细胞购自ATCC；地高辛购于Sigama公司；胎牛血清﹙fetalbovine serum，FBS﹚和McCoy’s 5A Medium 购于 Gibco公司；含 1%O2、5%CO2和94%N2低氧培养箱购于Thermo公司；聚凝胺（polybrene）购于科密欧公司；Transwell小室购于Corning公司；MTT试剂盒购于凯基生物公司；E-cadherin、N-cadherin、MMP2、SLUG、Vimentin、VEGF、β-actin和HIF-1α均为兔多克隆抗体，均购自Abcam公司；HRP标记山羊抗兔IgG购于Proteintech；反转录试剂盒和SYBR Green购于Takara公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HCT116细胞从液氮罐中取出后立即放入37℃水浴锅中解冻2min，细胞解冻后移入离心管中做好标记。1000r·min-1、离心5min后弃上清分别转入含有10%FBS、2.5%青霉素、2.5%链霉素的McCoy’s 5A培养基的培养皿中，放入37℃、5%CO2的培养箱培养。将细胞分为常规氧环境组（Normoxia组）、低氧环境组（Hypoxia组）、低氧环境+地高辛组（Hypoxia+Digoxin组）、阴性对照组（si-NC组）和HIF-1α干扰RNA组（si-HIF1α组）。Normoxia组细胞在常规含氧培养箱中培养；Hypoxia＋Digoxin组加入10μM的地高辛溶液（DMSO溶解），Hypoxia组加入等体积DMSO，待细胞贴壁后Hypoxia和Hypoxia+Digoxin组转入含1%O2、5%CO2和94%N2低氧培养箱中继续培养；si-HIF1α组和si-NC组由上海吉凯基因公司合成提供，si-HIF1α序列5＇-CTGATGACCA GCAACTTGA-3＇，引物序列见表 1。

 

表1 引物

  

因子 正义 反义VEGF 5-TGCCC GCTGCTGTC TAAT-3 5-TCTCC GCTCTGA GCAAGG-3 HIF-1α 5-GCACA GGCCACAT TCACG-3 5-TGAAGATTCAACCGGTTTAAGGA-3 β-actin 5-CTCCAT CCTGGCCT CGCTGT-3 5-GCTGTCACCTTCACC GTTCC-3

目前国有企业党群工作还存在不符合当前形势任务的问题：一是视野不宽。缺乏从宏观角度审时度势的本领。二是群众意识不强。没有做到从群众中来，到群众中去。三是改革创新意识不够。没有结合国有企业实际情况拿出工作举措，为企业自身持续快速发展提供强有力的支撑。四是工作人员必备素质不高。有的知识结构狭窄但不思求知求新，有的实践经验不足却还固步自封，有的作风浮躁务实不足等，影响了国有企业班子整体功能的发挥。

1.2.5 MTT测量HCT116细胞增殖能力 取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100μL约含5×104个细胞。根据MTT试剂盒测定步骤测量地高辛干预后不同时间点（0、24、48和72h）的细胞生长状态，在自动酶联免疫检测仪上选定490nm波长处测定光密度（OD）值，参比波长620 nm。实验设5个复孔，取平均值。细胞增殖能力（%）=（样本组OD值／对照组OD值）×100%。

与Hypoxia组相比，Hypoxia+Digoxin组VEGF与HIF-1α的mRNA相对表达量均降低（t＝3.22、4.41，P 均＜0.05）；与 si-NC 组相比，si-HIF1α 组VEGF与HIF-1α的mRNA相对表达量均降低（t＝3.42、5.47，P 均＜0.05），见表 2。

1.2.4 Western blot检测HCT116细胞中相关蛋白表达 培养细胞，待细胞达到对数生长期，用凯基全蛋白提取试剂盒进行全蛋白提取，BCA法定量后，进行SDS-PAGE电泳并低温下转移至PVDF膜。封闭液（TBST）封闭1h，分别加入E-cadherin、N-cadherin、MMP2、SLUG、Vimentin、VEGF 和HIF-1α抗体，并加入β-actin作为内参，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗常温下孵育 1 h，TBST洗膜 3次，ECL法显影。条带灰度值用Image J分析，计算目的蛋白灰度值与相应内参灰度值之比，重复3次，取平均值。

MTT实验结果显示，si-NC组24、48和72h细胞增殖能力高于si-HIF1α组（P＜0.05），Hypoxia组24、48和72h细胞增殖能力高于Hypoxia+Digoxin组（P＜0.05），见图 3。

2-阴离子聚合形成聚钼酸盐阴离子，控制不同的终点pH值，可得到不同的沉淀物。研究结果表明：当终点pH值为1.5左右时，生成四钼酸铵；当终点pH值为4.5左右时，生成七钼酸铵。其反应式如下：

1.2.6 Transwell迁移实验 取对数生长期细胞，用配置好的各实验组培养基制备2.5×108/L的细胞悬液，取200μL加入上室内，在下室加入600μL含FBS的培养基，置于培养箱中培养24h，每组设3个复孔。24h后弃掉孔内液体，将迁移的肿瘤细胞经甲醇固定和姬姆萨染液染色后，显微镜下每孔取6个视野拍照计数，取平均值。

1.3 统计学方法

Western blot结果表明，与Hypoxia组相比，Hypoxia+Digoxin 组中 HIF-1α、N-cadherin、MMP2、Vimentin、SLUG和VEGF蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高（P＜0.05）；与si-NC组相比，在 Si-HIF1α 组中 N-cadherin、MMP2、Vimentin、SLUG和VEGF的蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高（P＜0.05），见图 2。

2 结果

2.1 病毒转染后的转染率和HIF-1α蛋白表达的变化

si-HIF1α组和si-NC组转染效率都在90%以上。结果表明，肿瘤细胞株病毒转染成功，可进行后续实验，见图1。

  

图1 病毒转染后si-HIF1α组和si-NC组细胞形态

2.2 qRT-PCR检测各组细胞内VEGF和HIF-1αmRNA 水平

1.2.3 qRT-PCR检测HCT116细胞中相关因子mRNA 按照Trizol试剂盒说明书提取HCT116细胞的RNA，反转录为cDNA，分别以cDNA为模板扩增VEGF、HIF-1α和β-actin。RT-PCR反应条件：98℃预变性 30s；98℃变性 10s，56℃退火30s，72℃延伸10s，共 40个循环；4℃保存。β-actin作为内参，应用凝胶成像系统（Bio-rad）摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。计算采用2-ΔΔCt法。

1.2.2 HCT116细胞转染 细胞培养至对数生长期，消化离心后配置重悬细胞并计数，于转染前一天晚上取1×105个细胞接种到6孔板上，置于37℃、含5%CO2的常氧培养箱中培养。24h后待细胞生长融合到40%，根据预实验结果以MOI=100加入病毒，并加入 5μg·μL-1的 polybrene（1∶1000）。孵育12h后弃掉上层转染液，加入含10%FBS的McCoy’s 5A培养基培养，转入低氧培养箱中。并根据细胞生长情况及时更换培养基，在培养4~5d后，可在荧光显微镜下检测细胞的转染效率，荧光转染效率（%）=同一视野荧光显微镜下转染细胞数/相同视野下自然光中的细胞总数×100%。

 

表2 各组中VEGF和HIF-1α的相对表达水平（x±s）

  

与 si-NC 组比较 *P＜0.05，**P＜0.01；与 Hypoxia组比较 #P＜0.05

 

组别 VEGF HIF-1α si-NC 组 1.07±0.31 0.86±0.29 si-HIF1α 组 0.33±0.21* 0.24±0.22**Hypoxia 组 1.24±0.32 1.43±0.26 Hypoxia+Digoxin 组 0.46±0.27# 0.53±0.24#

2.3 Western blot检测各组EMT相关蛋白的表达水平

所有数据采用SPSS 22.0统计软件进行处理。计量资料采用均数±标准差﹙x±s﹚表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

  

图2 Western blot检测各组EMT相关因子蛋白表达的水平和半定量分析

2.4 干预后细胞增殖能力变化

VITC码是视频时间码的信号，只有稳定将图像信号加以取出，方能稳定读取VITC,稳定显示地址。由于VITC在之前或者之后都不能够将VITC加以记录，因此在某段视频信号消掉之后，相应的VITC将也同时消失信息。

(3) 《规范》对不同场所喷头的工作压力、喷头安装间距、喷头安装高度等均有新的规定，但根据地铁设备区自身存在的特点，可直接套用的依据不多。在此情况下，可通过实体火灾试验确定具体设计参数。

  

图3 不同时间各组肿瘤细胞的增殖能力

2.5 地高辛以及病毒转染后对细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，与si-NC组相比，si-HIF1α 组迁移细胞数降低（P＜0.05）；与Hypoxia组相比，Hypoxia+Digoxin组迁移细胞数降低（P＜0.05）。实验表明，缺氧环境下地高辛可以抑制结直肠癌HCT116细胞的迁移力，且下调HIF-1α的表达也可以达到同样的效果，见图4、表3。

  

图4 Transwell检测各组细胞迁移能力（姬姆萨染液染色，×10）

 

表3 各组肿瘤细胞迁移能力比较结果﹙x±s﹚

  

组别 迁移细胞数/个 t值 P值si-NC 组 113.00±20.56 7.47 0.0017 si-HIF1α 组 52.00±17.46 Hypoxia 组 149.00±26.11 10.65 0.0004 Hypoxia+Digoxin 组 77.00±21.87

3 讨论

近年来，HIF-1α在肿瘤发生、发展中的调控作用逐渐引起人们的关注。有研究表明[11-13]，下调HIF-1α的表达可以抑制脑神经胶质瘤、宫颈癌、乳腺癌等的生长，而且地高辛可以抑制HIF-1α的表达来起到抑制肿瘤生长的作用。地高辛是一种强心苷类药物通过抑制 Na+-K+-ATP酶发挥药理作用，促进心肌细胞内Ca2+-Na+交换，升高细胞内Ca2+的浓度，从而使心肌收缩力增强[14]。研究发现，强心苷类在治疗肿瘤上，与多种细胞内的通路相关，可以抑制肿瘤EMT的发展，降低肿瘤迁移和侵袭能力[15]。

本实验证实，在缺氧环境下RNA干扰及添加地高辛均可抑制HIF-1α的表达，细胞的增殖和迁移能力均受到抑制，且可以抑制肿瘤细胞EMT的发展，因而HIF-1α可以成为抑制肿瘤生长的关键靶点。在两组实验中对EMT标志性因子[16-18]的Western blot检测中，E-cadherin的表达增加，N-cadherin、MMP2、Vimentin、SLUG 的表达降低。其中E-cadherin的降低是EMT发生、发展的标志性生物学特征[19]，因而地高辛可以抑制EMT的发展。细胞转染后si-HIF1α与si-NC组比较，当下调HIF-1α的表达时，可以产生与添加地高辛时同样的生物学效应。因而地高辛可通过下调HIF-1α的表达抑制结直肠癌HCT116细胞EMT的增殖和迁移能力。基质金属蛋白酶（matrix metallproteinases，MMPs）是一类与肿瘤侵袭转移密切相关的蛋白水解酶[20]。MMPs降解细胞外基质，重塑细胞黏附力，促进合成和释放多种调节血管生长的因子，促进血管生成，激发潜在生物活性，参与肿瘤的免疫过程，因而在肿瘤的侵袭转移过程中起到关键的作用[21-22]。在本实验中，地高辛干预肿瘤细胞以及RNA干扰HIF-1α后，MMP2的表达降低，且VEGF的表达也降低，因而地高辛可通过下调HIF-1α，导致MMP2的表达降低，VEGF表达量减少，从而起到抑制肿瘤生长的作用。

综上所述，结直肠肿瘤中HIF-1α的表达增加，干扰HIF-1α可以抑制肿瘤的EMT过程及迁移能力，地高辛可以下调HIF-1α的表达，这提示HIF-1α在肿瘤的发生、发展中起关键作用，可通过靶向干扰HIF-1α来抑制结直肠癌的增殖和迁移能力，有广泛的临床应用前景。

（2）泥质、灰质含量较重的低电阻率油层。测井响应特征表现为：自然电位负异常，异常幅度与纯砂岩油层相比明显减小。泥质砂岩油层自然伽马为中等值，微电极低值正差异或无差异；灰质砂岩油层自然伽马值小于纯砂岩，微电极较高值锯齿状。三孔隙度曲线重合性较差，声波时差变化范围较大，为255～290μs／m，测井曲线间相关性相对较好，电阻率为1.1～3.0Ω·m。该类油层多分布在纯上6砂组中，由于物性较差，多为产液量低的差油层。

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