原发性肝癌（HCC）是消化系统中恶性程度高、病情发展快、病死率较高的一种恶性肿瘤，就诊时患者多数已到中晚期。因此，如何进行早期诊断及病程监测对于改善患者存活率有着重要意义。实验室检测指标在HCC的病情监测、诊断、鉴别诊断、疗效监测及预后评价中发挥着重要价值。但由于检测指标的局限性，往往需要根据患者的病情联合多项检测指标用于临床指导[1]。最近研究发现，一些新的免疫细胞、免疫分子用于HCC的病情监测和诊断治疗前景广阔[2]。Foxp3是Treg细胞功能性的转录因子和典型的标记物，Treg细胞在自身免疫性疾病及多种类型的肿瘤中发挥关键的负性免疫调控作用，研究显示HCC生存曲线与Foxp3的表达水平存在一定的相关性[3]。IL-33由肝星状细胞和大量的纤维细胞产生，IL-33的过表达与肝纤维化进展相关[4]，在HCC中IL-33的异常表达与肿瘤组织学分级呈负相关[5]。IL-15由活化的单核-巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生，对于Treg细胞的增殖有重要作用，在肝癌中促进CD8+T细胞免疫应答[6]。HCC患者血清中甲胎蛋白（AFP）含量变化的速率和程度与肿瘤的分化程度高低有一定的相关性，是HCC最重要的诊断指标之一。本研究探讨了HCC患者术前、术后外周血及癌组织中IL-15、IL-33和CD4+Foxp3+T细胞的变化，分析其与HCC临床检测指标AFP的相关性，以期发现可用于HCC疾病监测及辅助诊断的新免疫细胞亚群和免疫分子。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集宁夏医科大学总医院肝胆外科2016年6月-2017年4月确诊的HCC患者为研究对象，外周血标本取自手术治疗的31例HCC患者（其中男性20例，女性11例），肝癌和癌旁组织标本6例（其中男性4例、女性2例）；31例HCC患者的平均年龄（62.3±6.98）岁；其中25例乙肝表面抗原阳性，1例丙肝抗体阳性，其余5例患者均阴性；25例有慢性肝炎，22例有肝硬化，其诊断标准符合2017年原发性肝癌诊疗规范。对照组为健康志愿者 30例，平均年龄（60.7±9.11）岁，男性20例，女性10例。所有HCC病例术前均未采取放射、化学及免疫治疗，均为第一次接受手术治疗，并排除自身免疫疾病和某些组织器官炎症及其他感染。本研究中所有临床样本采取，均对患者进行知情告知并经宁夏医科大学总医院伦理委员会通过。两组患者年龄、性别构成差异无统计学意义（P＞0.05）。

据埃菲社11月17日报道，最近几年，数以百计的初创企业通过手机应用软件成功吸引了数以百万计的中国用户，这些应用软件提供各种价格极低的服务，现在这些服务已经延伸到时装和电子消费领域。

1.2 主要试剂和仪器

抗 CD4-异硫氰酸荧光素（CD4-FITC）、抗Foxp3-藻红蛋白（Foxp3-PE）均为BD公司产品，单个核淋巴细胞分离液为Coring公司产品；IL-33 ELISA试剂盒、IL-15 ELISA试剂盒购自美国RayBio生物公司。BDFACSAriaⅢTm流式细胞仪，BIO-RAD酶标仪。

1.3 检测方法

1.3.1 免疫组化、免疫荧光检测肝癌组织和癌旁组织中CD4、Foxp3的表达 取肝癌组织和癌旁5cm以上组织，经过固定，脱水，包埋成蜡块后切片4μm，脱蜡，抗原修复，封闭，滴加一抗（鼠抗人CD4 抗体 1.4 μg·mL-1，兔抗人 Foxp3 抗体 1μg·mL-1）4℃冰箱孵育过夜，对照组加PBS代替一抗4℃冰箱孵育过夜，次日PBS缓冲液洗涤后，滴加组化二抗（抗鼠抗体 1μg·mL-1或抗兔抗体 1μg·mL-1）37℃孵育 30min，PBS 缓冲液洗涤，DAB 显色7min，中性树胶封片后在光学显微镜下观察采图；免疫荧光检测则在次日PBS缓冲液洗涤后，滴加荧光二抗（抗鼠抗体1μg·mL-1及抗兔抗体 1μg·mL-1）30min，PBS 缓冲液洗涤后树胶封片用荧光显微镜采图。

HCC患者术前及术后第5天外周血中CD4+Foxp3+T细胞的比例高于对照组（P均＜0.01）；HCC患者术后外周血中CD4+Foxp3+T细胞的比例低于术前（P＜0.05），见图 3。

AFP值均为HCC患者术前抽取外周血经检测得到。HCC患者术前IL-15水平、CD4+Foxp3+T细胞比例与AFP呈正相关（P均＜0.01），IL-33与AFP无相关性（P=0.0682），见图 5。

对HCC患者肝癌及癌旁组织进行免疫组化染色，阳性染色呈棕褐色，可见CD4分子表达于淋巴细胞的细胞膜上，CD4+淋巴细胞在肿瘤组织局部多聚居在血管周围，以此为中心分散表达在肿瘤组织中；Foxp3蛋白表达在淋巴细胞的细胞质中，分布方式和CD4相似但数量明显减少，见图1。进一步通过免疫荧光检测CD4、Foxp3共表达情况，CD4表达于细胞膜上，Foxp3表达于细胞质中，当两者进行重叠以后发现Foxp3与CD4共表达于淋巴细胞，Foxp3阳性细胞均有CD4分子表达，Foxp3、CD4共阳性的细胞在肝癌组织局部散在广泛分布，在癌组织中共阳性细胞较癌旁组织中分布更加密集，见图2。

1.4 统计学方法

HCC患者术前血浆IL-33水平高于对照组（P＝0.019）和术后（P＝0.004），术后与对照组比较差异无统计学意义（P＝0.274）。HCC患者术前血浆IL-15水平与对照组比较差异无统计学意义（P＝0.334），术后IL-15水平低于术前和对照组（P＝0.001/0.001），见图 4。

2 结果

2.1 HCC患者肝癌及癌旁组织中CD4、Foxp3阳性细胞的分布

1.3.3 ELISA检测HCC患者血浆IL-15和IL-33水平 分离对照组与HCC患者术前及术后外周血血浆，检测IL-15、IL-33的表达水平。ElISA试剂盒购自RayBio美国生物公司。采用双抗体夹心法，严格按照说明书操作，最后酶标仪读数，以10为底取对数进行统计分析。

2.2 HCC患者术前、术后外周血中CD4+Foxp3+T细胞比例的变化

贾承造：目前，我国天然气消费快速增长，成为世界第三大天然气消费国。天然气在我国一次能源消费结构中占比达到7.3%。其中，城镇燃气、交通、工业燃料和天然气发电消费增长明显，占比分别为燃气25.8%，交通13.5%，工业燃料31.8%，天然气发电17.9%，化工用品11%。2017年，全国天然气消费增量主要集中在环渤海、长三角和西南地区，这3个地区的消费增量占了全国的一半。全国用气量超过100亿立方米的有江苏省、广东省、四川省、新疆维吾尔自治区、北京市和山东省6个省市和地区。

2.3 HCC患者血浆IL-15、IL-33水平的变化

实验所得数据采用SPSS 22.0软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，单因素方差分析和SNK-q检验进行多组数据比较，t检验比较两组均数，P≤0.05为差异有统计学意义。

2.4 HCC患者术前外周血 CD4+Foxp3+T细胞、IL-15、IL-33与AFP相关性分析

1.3.2 流式细胞术检测HCC患者外周血中CD4+Foxp3+T细胞比例 抽取HCC患者外科手术前1天和手术后第5天外周血5mL于EDTA抗凝管1500r·min-1离心10min，制备单个核细胞。取1mL的 1×106/mL细胞进行染色，加入1μL CD4-FITC避光孵育20min，破膜后加入0.625μL Foxp3-PE 避光孵育 30min，离心 1500r·min-1，5min，洗涤2次，上机检测。选取淋巴细胞群设门，Flowjo软件分析CD4+Foxp3+T细胞比例，统计分析结果。

很多人担心口服短效避孕药的安全性。随着药物剂量的变化，目前药物的雌孕激素水平已经处于比较低的一个有效剂量，对人体是非常安全的。它可以作为育龄健康女性的常规避孕方式。

乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸链球菌合成的一种多肽抗菌素，能有效抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡糖球菌、溶血性链球菌、单增李斯特菌、肉毒杆菌，是国际上公认的天然防腐剂。研究表明[11]，在不影响色泽和防腐的情况下，添加Nisin可使亚硝酸盐的含量由原来的150 mg/kg降到40 mg/kg。若添加0.2 g/kg Nisin, 则亚硝酸盐的添加量减少到 0.04 g/kg，香肠中的菌落总数可降低到3200 cfu/g，抑菌效果明显。

  

图1 HCC患者癌及癌旁组织中CD4、Foxp3的阳性表达情况（SP×400）

  

图2 HCC患者癌及癌旁组织中CD4、Foxp3共表达情况（SP×400）

  

图3 HCC患者术前及术后外周血中CD4+Foxp3+T细胞比例的比较

  

图4 HCC患者术前及术后血浆IL-15、IL-33水平的变化

  

图5 HCC患者术前IL-15、IL-33、CD4+Foxp3+T细胞比例与AFP相关性分析

3 讨论

乙型肝炎病毒感染患者在我国是HCC高风险人群[7-8]，AFP对于HCC的诊断特异性可达到70%以上，是HCC诊断中最重要的指标之一。病理学检验是HCC确诊的金标准，但检查应用范围较实验室指标更加局限[9]。随着肿瘤免疫学的飞速进展，新的细胞亚群和细胞因子不断出现，不同T细胞亚群比例的变化、细胞因子表达水平的改变可能对HCC的病情监测、临床诊疗具有新的指导意义[10]。为了进一步提高HCC进展的监测水平和辅助诊断的特异性，AFP联合新的免疫细胞亚群和免疫分子对HCC进展监测和辅助诊断有着潜在的临床价值。在HCC肿瘤微环境局部，本研究对CD4及Foxp3的表达进行观察，发现CD4+细胞广泛浸润于癌组织中，且在汇管区密集分布，在癌旁组织中分布稀少分散，提示CD4与Foxp3的富集与HCC肿瘤进展有着密切关系。通过免疫荧光可以发现Foxp3阳性表达主要表现在CD4+细胞上，提示共阳性的这类细胞亚群可能与肿瘤环境中的免疫逃逸机制相关。HCC患者术后CD4+Foxp3+T细胞比例、IL-15及IL-33的表达水平均低于术前，且术前IL-15水平、CD4+Foxp3+T细胞比列均与AFP呈正相关关系，提示CD4+Foxp3+T细胞与IL-15、IL-33的变化与患者肿瘤的进展相关。因此，认为CD4+Foxp3+T细胞与IL-15、IL-33参与了肝癌的进展，检测CD4+Foxp3+T 细胞、IL-15、IL-33与 AFP 可为HCC的病情监测、辅助诊断提供一定参考。

HCC肿瘤组织局部肝细胞癌变，肿瘤微环境中的炎症反应、免疫细胞间的动态平衡被打破，从而影响肿瘤的进展，造成组织细胞的高度异质性[11-12]。在肿瘤发生发展过程中，免疫应答功能低下，促进肿瘤的生长及迁徙。本研究发现CD4+Foxp3+T细胞在HCC术前外周血中增高，术后下降，提示这一群细胞与HCC肿瘤微环境中肿瘤细胞的免疫逃逸机制相关。CD4+Foxp3+T细胞在免疫应答中发挥免疫抑制功能，使得效应性免疫细胞不能有效地抑制和杀伤肿瘤细胞，使肿瘤细胞逃脱免疫监视。免疫细胞比例和功能的失调破坏了细胞因子的动态平衡。本研究发现IL-15、IL-33的表达水平在术前上升，术后降低。IL-15在T细胞增殖、转化及抑制凋亡中发挥作用，在胰腺导管癌中IL-15可以通过刺激NK细胞辅助杀伤肿瘤细胞[13]，提示其在肿瘤细胞的生长、分化过程中可能发挥协同作用，术后IL-15水平减少，可能与HCC术后患者免疫力低下，免疫细胞功能处于重塑阶段有关。IL-33主要由成纤维细胞分泌，在小鼠肾纤维化中IL-33发挥关键作用[14]。在小鼠小细胞肺癌模型中，IL-33的阻断有效抑制了肿瘤的生长[15]。HCC患者术后IL-33的降低，提示肿瘤细胞的生长、分化能力减弱。国内HCC的发展多是由肝炎进展为肝硬化最后发展为肝癌，肿瘤中肝脏纤维化的发生及肿瘤局部毛细血管组织增生影响IL-33的水平变化，可能与HCC的进展及严重程度相关。本实验中检测到HCC患者血浆IL-33的水平高于正常水平，术后又出现了一定水平的下降，提示HCC患者外周血中IL-33分泌增加可能与疾病发展过程中肝脏功能的恶化、肿瘤的进展有一定的关系。

肝脏生物学功能复杂，往往难以根据某一指标进行临床检查，目前仍没有一种理想的实验室检查方案可以全面、特异性地反映肝脏功能从而监测HCC肿瘤进展情况。探索更多潜在的靶点来监测疾病进展及辅助临床诊疗意义重大。本课题探讨了术前外周血中CD4+Foxp3+T细胞及IL-15、IL-33与HCC特异性肿瘤标志物AFP的相关性，检测CD4+Foxp3+T细胞比例及IL-15、IL-33表达水平的动态变化，可能对HCC的诊断及疾病进展的评估具有一定的临床价值。2017年HCC诊疗指南也将免疫治疗方法纳入全身治疗手段，免疫治疗针对人体免疫系统而非直接针对肿瘤细胞，为治疗肿瘤提供新的途径，甚至可能成为完全治愈肿瘤的潜在治疗方法。

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