肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由多种因素引起的一种慢性、进行性、弥漫性的肝脏病理改变，以肝星状细胞（HSC）增殖，细胞外基质（ECM）沉积为特点，发生肝细胞变性、坏死，继而再生和纤维组织增生，严重时发生肝硬化、肝癌等疾病[1-2]。参与HSC活化过程的因素众多，如细胞因子、生长因子、氧化应激产物等，但均需要通过HSC细胞内的信号转导才能发挥作用。Wnt/β-catenin信号通路具有很强的促细胞分化或转化效能，如上皮细胞向间质细胞转化（EMT）[3]，而EMT在肝纤维化发展中也发挥了关键作用。Arellanes-Robledo等[4]在对离体的人HSC进行体外培养，结果发现累积的β-catenin蛋白定位于细胞核上，能够上调促进纤维化的基因的表达。李文庭等[5]将载有Wnt抑制因子-1的真核表达质粒转染HSC-T6，并用RT-PCR和Western blot法检测发现，其活性较转染对照组和阴性组明显下降，同时α-SMA、Smad3及β-catenin的表达下降，表明阻断Wnt信号通路可抑制HSC的活化。

中医药治疗肝纤维化是从病因、病机着手，可多靶点、整体调节，疗效全面，在临床应用中取得了一定的疗效。肝纤维化的病位在肝，肝主藏血。《临证指南医案·肝风》中有：“故肝为风木之脏，因有相火内寄，体阴用阳，其性刚，主动主升，全赖肾水以涵之，血液以濡之。”养营活血汤是基于“肝藏血”和“肝体阴用阳”的理论，以“营虚血瘀”为HF核心病机，在《太平惠民和剂局方》四物汤基础上演化而成。前期的实验研究表明养营活血汤可降低大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的含量，可明显抑制核因子-kB（NF-kB）mRNA的表达，改善肝组织的纤维化程度[6-7]，但前期缺少养营活血汤对Wnt/β-catenin信号通路影响的研究。因此，本实验以肝纤维化大鼠为研究对象，观察养营活血汤对Wnt/β-catenin信号通路 Wnt1、β-catenin、TGF-β1的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重160～200g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2016-0011，饲养于SPF级动物室。

1.2 药品与主要试剂

养营活血汤组成:黄芪15g、当归15g、生地黄40g、熟地黄 15g、白芍 15g、赤芍 15g、川芎 12g、丹参 12g、玄参 12g、浙贝 15g、生牡蛎 30g、金银花15g、连翘 15g、虎杖 18g、泽兰 10g、炙甘草 9g，由宁夏医科大学附属回医中医医院制备。

四氯化碳（CCL4）分析纯（徐州天鸿化工有限公司，批号56-23-5），液体石蜡（徐州天鸿化工有限公司，批号8042-47-5），猪血清（南京森贝伽生物有限公司，批号165126），秋水仙碱、大鼠透明质酸（HA）ELISA检测试剂盒、层黏连蛋白（LN）ELISA 检测试剂盒、III型前胶原（PC III）及IV型胶原（IV-C）ELISA检测试剂盒均购自上海宝曼生物科技有限公司，货号分别为HZ 20160505、CK-E30401R、CK-E30645R、CK-E91483R、CKE30178R。Trizol（Invitrogen，货号Cat 15596-026），TianScript RT KIT（天根生物科技有限公司，货号Cat KR104-02），SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根生物科技有限公司，货号Cat FP205）。

1.3 主要仪器

肝纤维化（HF）不是独立的疾病，许多慢性肝病如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等均能引起肝纤维化。其临床表现缺乏特异性，患者可出现乏力、眩晕、纳差、腹胀、肝区不适、黄疸等不典型症状和体征。中医学中没有肝纤维化的概念，通常将其归属于“胁痛”、“癥积”、“臌胀”、“痞证”等范畴。中医对肝纤维化的病因病机有广泛的认识，认为瘀、毒、湿、热、虚等均是肝纤维化形成的病理因素。肝纤维化的形成并非一时，往往是各种急慢性肝病长期发展的结果，日久累及气血[8-9]。养营活血汤中当归补血活血；川芎活血祛瘀、理气疏肝；熟地滋阴补肾、调经补血；白芍补血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗；赤芍行瘀止痛，凉血消肿；生地清热生津、破瘀生新、凉血止血；丹参活血调经，祛瘀止痛；陈皮疏肝健脾，调中，燥湿，化痰，活血化瘀，行水消肿；泽兰活血化瘀，解毒消肿；柴胡疏肝解郁；炙甘草补脾和胃，益气复脉；大枣补中益气，养血安神。全方具有养营活血行气之功效。

言语就搁在那儿进行不下去了。冯一余尴尬地蹭了一会儿，又说，其实，其实这也不能算是雇用什么的，其实这也是互相帮助嘛。老人互相看看，没有再搭理他。其中一个说，差不多了，回家煮晚饭了。一个个都站了起来，走了，把冯一余一个人扔在那里。

1.4 方法

单因素方差分析结果显示，不同组间大鼠血清HA、LN、PC III、IV-C水平差异均有统计学意义（P均＜0.01）。与正常对照组相比，模型对照组、养营活血汤低、中、高剂量组和秋水仙碱组大鼠血清HA、LN 、PC III、IV-C水平均增高（P均＜0.01）；与模型对照组相比，不同剂量养营活血汤组和秋水仙碱组大鼠血清HA、LN、PC III、IV-C水平降低（P均＜0.01）；随着养营活血汤浓度的增加，HA、LN、PC III、IV-C 水平依次降低（P＜0.05）；且高剂量组大鼠血清HA、LN、PC III、IV-C水平较秋水仙碱组降低（P均＜0.05），见表 2。

各组大鼠肝组织中 Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA表达水平差异均有统计学意义（P＜0.01）。与正常对照组相比，模型对照组、养营活血汤低、中、高剂量组和秋水仙碱组Wnt1、β-catenin、TGF-β1的mRNA表达水平均增高（P均＜0.05）；与模型对照组相比，养营活血汤不同剂量组和秋水碱组的 Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA 表达水平均降低（P均＜0.01）。与秋水仙碱组相比，养营活血汤不同剂量组 Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA表达水平差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表3。

1.5 指标测定

HE染色镜下观察：正常对照组大鼠肝脏细胞无变性、坏死，排列正常，小叶结构正常，汇管区间质无异常增生；模型对照组大鼠肝细胞出现变性、坏死，有空泡样改变，小叶结构破坏严重，并可见汇管区和中央静脉有炎性细胞浸润，纤维组织异常增生，假小叶形成。与模型组相比，养营活血汤低、中、高剂量组和秋水仙碱组大鼠肝细胞变性、水肿、坏死程度明显减轻，肝小叶结构破坏程度减轻，纤维组织增生明显减少，可见少量炎性细胞浸润和细胞脂肪变性的现象。其中以高剂量组改善最为明显，细胞水肿程度较轻，汇管区炎性细胞浸润较少，无异常增生，无假小叶（见图1）。Masson染色：染色图中蓝色组织则为胶原纤维，正常对照组大鼠肝组织中小叶结构正常，肝细胞绕中央静脉成放射状排列且结构正常，细胞周围有少量胶原纤维排列整齐；模型组大鼠肝小叶被破坏，中央静脉、汇管区及肝实质内有大量的纤维组织增生和胶原沉积，并形成假小叶；与模型对照组比较，养营活血汤低、中和高剂量组及秋水仙碱组纤维结缔组织增生逐渐减少（见图 2）。

1.5.2 肝组织病理学检测 HE和Masson染色后，光镜观察各组大鼠肝组织病理变化情况。

1.5.3 实时荧光定量PCR检测肝组织Wnt1、βcatenin、TGF-β1 mRNA的表达水平 用Trizol提取组织样本中总RNA，浓度调平后用TIANScript RT KIT进行反转录，用荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct法进行数据相对定量分析，△△Ct=（待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值）-（对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值）。计算得到Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA的相对表达量，内参基因扩增引物序列表见表1。

 

表1 引物序列

  

基因名称 序列 产物长度/bp β-catenin GGAGGAGATAGTTGAAGGG 103 CACAAACAGTGGAATGGTA Wnt1 CGAAACCGCCGCTGGAACTG 106 CGGAGGTGATTGCGAAGATAAAC TGF-β1 TGGACCGCAACAACGCAATCTA 110 CAGCAATGGGGGTTCTGGCACT β-actin CCTAGACTTCGAGCAAGAGA 140 GGAAGGAAGGCTGGAAGA

1.5.4 Western blot法检测肝组织中 Wnt1、βcatenin、TGF-β1蛋白的表达 取出备用肝组织块，称取肝组织100mg，细胞裂解液（由50mM Tris base、150mM NaCl、0.1%SDS 组成）提取总蛋白，依照说明书，用考马斯亮蓝法测定组织样本蛋白含量。配置10%分离胶、4%浓缩胶，电泳仪电压调至80v上样跑胶，使染料至分离胶适当位置。采用半干转的转膜方式将凝胶上分离到的蛋白条带转印至PVDF膜上，分别用非标记一抗（抗体稀释度均为1∶300）及辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3000）对其进行孵育、检测。曝光与洗片后，用Mage J软件对其进行灰度值扫描，以β-actin为内参蛋白，计算肝组织中Wnt1、β-catenin、TGF-β1蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法

各组大鼠肝组织中 Wnt1、TGF-β1、β-catenin蛋白表达水平差异均有统计学意义（P均＜0.01）。与正常对照组相比，模型对照组、养营活血汤低、中、高剂量组和秋水仙碱组Wnt1、β-catenin、TGF-β1蛋白表达水平均增高（P均＜0.05）；与模型对照组相比，养营活血汤中、高剂量组和秋水碱组肝组织中 Wnt1、β-catenin、TGF-β1 蛋白表达水平降低（P＜0.01），且养营活血汤的降低效果呈现剂量依赖性（P＜0.05）；而高剂量组表达水平较秋水仙碱组降低（P＜0.01）。Wnt1、β-catenin、TGF-β1蛋白表达水平见表4，电泳图见图3。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理改变

1.5.1 血清中HA、LN、PC III、IV-C的检测 分别用大鼠 HA、LN、PC III、IV-C ELISA 试剂盒检测，严格按操作说明进行。

  

图1 各组大鼠肝组织HE染色（×100）

  

图2 各组大鼠肝组织Masson染色（×100）

2.2 养营活血汤对肝纤维化模型大鼠血清HA、LN、PC III、IV-C 含量的影响

1.4.1 造模与给药 大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型对照组、养营活血汤高、中、低剂量治疗组、秋水仙碱治疗组6组，每组10只，除正常对照组外，其余5组均按经典的CCL4诱导造模方法制作大鼠肝纤维化模型：皮下注射40%CCL4与石蜡油混合液，首剂注射量5mL·kg-1，之后按照3mL·kg-1计算，每4d注射1次，同时在注射CCL42d后腹腔注射猪血清，首次2mL·kg-1，之后1mL·kg-1，每4d注射1次，8周后大鼠肝纤维化模型建立成功。造模成功后正常对照组、肝纤维化模型对照组大鼠给予生理盐水10mL·kg-1体重灌胃，秋水仙碱治疗组给予秋水仙碱0.2mg·kg-1体重灌胃，养营活血汤高、中和低剂量治疗组分别予 4.734g·mL-1、2.367g·mL-1、1.183g·mL-1，按照2mL/200g剂量每天上午10点灌胃1次，持续灌胃8周。采集组织样本时，每组存活大鼠数量：正常对照组10只，模型对照组8只，低剂量组9只，中剂量组10只，高剂量组9只，秋水仙碱组9只。

 

表2 不同组间大鼠血清 HA、LN、PC III、IV-C 水平比较（x±s，ng·mL-1）

  

与正常对照组比较*P＜0.01；与模型对照组比较△P＜0.01；与低剂量组比较▲P＜0.01；与中剂量组比较 #P＜0.01，##P＜0.05；与高剂量组比较◆P＜0.01，◆◆P＜0.05

 

组别 n HA LN PC-III Ⅳ-C正常对照组 10 198.12±19.99 216.59±31.17 25.01±3.35 13.24±1.51模型对照组 8 405.77±30.56* 496.34±41.72* 49.51±4.51* 25.28±2.29*低剂量组 9 336.92±18.71*△ 362.39±57.53*△ 43.83±2.13*△ 22.35±1.13*△中剂量组 10 297.18±19.45*△▲ 350.17±29.54*△ 37.44±1.89*△▲ 19.11±0.93*△▲高剂量组 9 253.91±19.16*△▲# 300.51±38.95*△▲## 31.08±3.09*△▲# 15.95±1.52*△▲#秋水仙碱组 9 301.27±12.30*△▲◆ 356.09±21.55*△◆ 36.29±2.98*△▲◆ 18.08±1.71*△▲◆◆F值 93.216 45.211 63.236 60.524 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织中Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA 表达水平

1.4.2 标本采集制备 灌药8周后大鼠禁食12h，称重后，10%水合氯醛按3mL·kg-1腹腔注射麻醉。消毒后打开腹腔，腹主动脉取血于抗凝管内，静置 1h 后，3000r·min-1离心 10min，取上层血清保存于-20℃冰箱中备用。抽取血液后的大鼠摘取其肝脏，在左叶同一位置取约1cm×1cm大小的肝组织，生理盐水冲洗后放入4%的多聚甲醛中固定，制作病理切片，并做HE染色和Masson染色。另外每组随机选择4只大鼠，取约0.5cm×0.5cm大小的肝组织，冲洗后放入标记好的冻存管，于-80℃冰箱保存备用，用于检测肝组织中 Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA 和蛋白表达水平。

2.4 Western blot法测定大鼠肝组织Wnt1、βcatenin、TGF-β1蛋白表达水平

采用SPSS 20.0统计软件对结果进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2018年是ABB持续投资中国、优化业务布局的一年。例如，ABB在重庆设立的机器人应用中心正式开业，以重点满足西部地区汽车、3C产品制造、装备制造和消费品制造等领域对工业机器人快速增长的市场需求；不久前，ABB宣布将投资1.5亿美元，在上海康桥建设其全球最大、最先进的机器人超级工厂，以扩大产能，提升效率，巩固领先的市场地位，更好地满足激增的客户需求；而投资额约3亿美元的ABB厦门工业中心将分散于厦门岛内的多家企业合而为一，全面提升ABB自身的生产效率和核心竞争力。

 

表3 实时荧光定量PCR检测各组大鼠肝组织Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA表达水平比较（x±s）

  

与正常对照组比较 *P＜0.01，**P＜0.05；与模型对照组比较△P＜0.01

 

组别 n Wnt1 β-catenin TGF-β1正常对照组 4 1.095±0.164 1.251±0.238 1.119±0.144模型对照组 4 8.981±0.734* 42.014±15.934* 16.929±2.179*低剂量组 4 3.370±0.623*△ 13.933±1.392**△ 12.317±1.841*△中剂量组 4 3.545±0.467*△ 8.045±0.689**△ 8.371±1.375*△高剂量组 4 2.834±0.544*△ 6.501±1.162**△ 4.890±1.179*△秋水仙碱组 4 3.512±0.467*△ 8.046±0.525**△ 7.765±1.558*△F值 100.770 19.937 53.181 P值 0.000 0.000 0.000

 

表4 Westem blot测定各组大鼠肝组织中 Wnt1、β-catenin、TGF-β1蛋白表达水平比较（x±s）

  

与正常对照组比较 *P＜0.01，**P＜0.05；与模型对照组比较△P＜0.01；与低剂量组比较▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；与中剂量组比较 #P＜0.01；与高剂量组比较◆P＜0.01

 

组别 n Wnt1 β-catenin TGF-β1正常对照组 4 0.241±0.053 0.261±0.047 0.220±0.032模型对照组 4 0.784±0.033* 0.766±0.014* 0.759±0.009*低剂量组 4 0.764±0.143* 0.652±0.004*△ 0.630±0.024*△中剂量组 4 0.604±0.037*△▲ 0.600±0.031*△▲▲ 0.563±0.039*△▲▲高剂量组 4 0.362±0.044**△▲# 0.326±0.024*△▲# 0.328±0.028*△▲#秋水仙碱组 4 0.553±0.067*△▲◆ 0.592±0.018*△▲◆ 0.473±0.053*△▲#◆F值 34.906 213.514 139.592 P值 0.000 0.000 0.000

  

图3 大鼠肝组织中Wnt1、β-catenin、TGF-β1和β-actin蛋白表达

3 讨论

酶标仪（Bio-Rad公司）；涡旋振荡仪（QL-902海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；离心机（Centrifuge5415D Eppendorf）；生物分光光度计（BioPhotometer Eppendorf）；荧光定量 PCR 仪（ABI7500 Applied Biosystems）；去离子水仪（PALL Purelab Plus美国）；PVDF膜（Millipore美国）；高速离心机、低温离心机（Eppendorf德国）；石蜡切片机（杭州艾普仪器设备有限公司）；转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司）；垂直电泳槽、转移槽（北京六一仪器厂）。

肝纤维化的发生过程中有许多细胞信号传导通路参与了肝星状细胞（HSC）的激活及肝纤维化的形成，在这些通路中，Wnt/β-catenin信号通路的调控成为抗肝纤维化治疗的一个重要靶点，在肝纤维化发展中起重要作用，包括促使HSCs活化、调节上皮细胞-间充质转化（EMT）、调节基质的合成以及众多生长因子表达方面。TGF-β是目前公认的纤维化疾病发展过程中起关键作用的细胞因子[10]，能够对HSC进行活化。Wnt/β-catenin信号通路与TGF-β信号之间存在着诸多联系。Wnt/β-catenin信号中Axin和GSK-3化合物通过控制Smad3蛋白的稳定性影响TGF-β 信号[11]。Zhou等[12]发现，β-catenin信号通路和TGF-β信号之间，通过相互作用共同调节EMT形成，通过转录共激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB）-结合蛋白CBP发挥作用。Wnt蛋白可以使胞浆内β-catenin降解受阻，导致胞核内β-catenin水平升高，与基因特异性转录因子LEF1/TCF结合引起靶基因的转录，从而导致EMT的发生[13]，而EMT在肝纤维化发展中也发挥了关键作用。

本实验基于Wnt/β-catenin信号通路探讨养营活血汤治疗肝纤维化的作用机制。病理结果显示养营活血汤可明显改善肝纤维化大鼠肝细胞变性、水肿、坏死程度，减少炎性细胞浸润和细胞脂肪变性，减轻纤维组织增生；降低血清肝纤维化标志物HA、LN、PC III、Ⅳ-C的含量。RT-PCR和Western blot结果显示，用养营活血汤干预的大鼠肝组织内 Wnt1、β-catenin、TGF-β1 mRNA和蛋白质表达水平上均低于模型组大鼠和秋水仙碱组大鼠。因此，可以认为养营活血汤可减少肝纤维化大鼠肝组织中Wnt1、β-catenin、TGF-β1的表达，从而下调或抑制Wnt/β-catenin信号通路激活的过程，达到缓解肝纤维化的目的。

近些年，中国大豆行业内的企业都用“过冬”形容所处的环境——产能过剩，行业恶性竞争，寡头垄断，超级巨企一统江湖，外资控制定价权，行情走势国际化，金融化竞争激烈，这就是大豆行业的“冬天”。目前，中国大豆行业已从传统农产品行业的成本、品质、市场、品牌等方面的竞争，升级为系统能力的竞争，拼芝加哥期货的点价能力、拼国内的期货套保能力、拼终端市场的基差销售能力，拼采购环节中对人民币和美元两个币种、对境内和境外两个货币市场、对利率和汇率两种工具综合运用的系统能力，金融化程度越来越高，企业经营稍有不慎，就会瞬间倒下。

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