慢病毒载体是一种新型的载体，具有高感染、高表达性等特点，能将携带的目的基因有效地导入宿主细胞，并将其整合到宿主细胞基因组中，从而使目的基因持久稳定地表达[1]。RNA干扰（RNAi）是通过特异性降解靶基因从而抑制基因表达，它所介导的基因沉默具有易操作性和适用于大多数细胞株的优点，特别是基于DNA载体技术产生的短发夹RNA（shRNA），在U6或H启动子驱动下可使基因沉默被长期诱导[2]。把RNAi技术和慢病毒载体相结合，有助于高效表达shRNA[1]，已成为基因治疗研究中的一个重要工具。

肝细胞肝癌（HCC）是具有高度侵袭性的恶性肿瘤，易发生转移是导致肝癌预后差的主要原因[3]。近年来，ITGA5在肝癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症中的研究越来越多[4-9]。ITGA5是整合素家族中的重要一员，它一方面从细胞外传递信息调节细胞黏附、扩散、迁移、生长、侵袭等[10-12]，另一方面，整合素细胞质域的调控依赖细胞外的生物化学成分[13-14]。为了深入了解ITGA5基因和蛋白质在肝癌发展中的作用机制，我们利用慢病毒介导的RNAi，构建了针对ITGA5的shRNA慢病毒表达载体，并在体外感染人肝癌细胞Bel-7404，筛选出稳定沉默ITGA5的细胞株，为进一步研究敲减ITGA5后对肝癌细胞生物学行为的影响及为治疗肝癌开发新药物提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Bel-7404细胞（复旦细胞库），DMEM高糖培养基、PBS、胰酶（Gibco公司），胎牛血清（Gemini公司），全蛋白提取试剂盒、ECL显影剂、BCA试剂盒（凯基公司）。逆转录试剂盒（Thermo公司）、Trizol、异丙醇、甲醇、乙醇、氯仿、脱脂奶粉（BD公司）。抗Integrinα5兔单克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体（GAPDH）（Abcam），二抗山羊抗兔抗体、山羊抗鼠抗体（Abbkine），PVDF膜（Milipore Corporation）。GeneRuler 1 kb DNA Ladder、T4 DNA ligase（Thermo Scientific），Primer（GeneRay），AgeI及 EcoRI限制性内切酶、GV493质粒、pHelper 1.0、pHelper 2.0质粒、HEK-293T 细胞、大肠杆菌菌株DH5α购自（吉凯基因公司）。天根无内毒素质粒小提中量试剂盒、嘌呤霉素（puromycin）（Sigma-Aldrich），DMSO（上海试一化学试剂有限公司），Taq Plus DNA polymerase（Vazyme），EndoFree midi Plasmid Kit（TIANGEN），Restriction Endonuclease（NEB）。

1.2 shRNA靶点设计

根据GeneBank提供的ITGA5的基因序列（NM_002205.2）及shRNA的设计原则设计3个靶序列（分别命名为ITGA5-RNAi-1、ITGA5-RNAi-2、ITGA5-RNAi-3）和1个RNAi阴性对照（Negative Control，NC）序列，见表 1。

 

表1 ITGA5 RNAi靶点及相应shRNA序列

  

注：下划线是TTGA5RNAi靶点序列，NC为阴性对照

 

靶序列ITGA5-RNAi-1 shRNA 序列（5'-3'）F:5'-CcggCTCCTATATGTGACCAGAGTTCTCGAGAACTCTGGTCACATATAGGAGTTTTTg-3'R:5'-aattcaaaaactCCTATATGTGACCAGAGTTCTCGAGAACTCTGGTCACATATAGGAG-3'ITGA5-RNA-2 F:5'-CcggccACTGTGGATCATCATCCTACTCGAGTAGGATGATGATCCACAGTGGTTTTTg-3'R:5'-aattcaaaaaccACTGTGGATCATCATCCTACTCGAGTAGGATGATGATCCACAGTGG-3'ITGA5-RNA-3 F：5'-CcggccTCAGGAACGAGTCAGAATTCTCGAGAATTCTGACTCGTTCCTGAGGTTTTTg-3'R:5'-aattcaaaaaccTCAGGAACGAGTCAGAATTCTCGAGAATTCTGACTCGTTCCTGAGG-3'NC F:5'-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3'R:5-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTAAACGTGACACGTTCGGAGAA-3'

1.3 重组慢病毒载体的构建

将合成的单链引物退火形成双链DNA 1μL（100ng·μL-1），用 AgeI和 EcoRI将 GV493 质粒进行双酶切。利用T4 DNA ligase 1μL将退火形成的双链DNA和酶切后的质粒在16℃下过夜连接，形成重组质粒。重组质粒转化感受态细胞DH5α，挑取单个菌落进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳鉴定，将鉴定出的阳性克隆转化子进行测序。使用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒从测序正确的菌液中抽提质粒。

按照最大隶属度原则取max(E)，根据max(E)所对应的窖泥质量等级，即：max(E)=E9，得出窖泥模糊综合评价等级为九级。同理根据专家评估，经模糊综合运算得出另外9口窖池窖泥质量等级。最后将窖泥质量评价情况与该厂窖池档案记录情况进行比对，结果基本一致，验证了该模型的科学性、适用性。

综上可知，学者们普遍认为，农村公共服务政府供给的单一模式存在各种弊端和不足，因此不断探讨新的供给模式。从供给主体来看，多主张由单一模式转向多中心模式，包括以政府为主导，多方进行合作和参与。在选择农村公共服务供给的内容时，应有先后次序，比如有人提出教育优先。在运作过程中，有人主张进行市场化运作。在供给导向上，多主张以农民需求和农民满意度为导向。

1.4 重组慢病毒载体的包装纯化与滴度测定

培养293T细胞使其处于对数生长期，加入含GV493载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0 载体质粒 10μg的培养液。共转染48 h后收集上清液，25000r·min-1离心10min、过滤上清液、25000r·min-1再离心2h。弃去上清，加入病毒保存液进行重悬，高速离心后取上清分装保存于-80℃。将293T细胞悬液取100μL，每孔4×104个铺于96孔板中，贴壁后，使用无血清培养基以10倍梯度稀释待测病毒原液并分别加90μL于各孔中，感染24h后更换新鲜培养基，感染 72h后加入5μg·mL-1puromycin继续培养1d，观察细胞生长状况。慢病毒具有puromycin抗性，采用药筛法测病毒滴度，通过感染后的活细胞数量来计算病毒滴度。病毒滴度（TU/mL）=（活细胞数/病毒原液量mL）×稀释倍数。

1.5 慢病毒感染BEL-7404细胞及筛选稳定沉默细胞系

构建ITGA5-RNAi慢病毒载体（图1），将转化感受态细胞后的阳性克隆子进行测序，序列检测结果显示与设计的引物序列吻合（图2），说明ITGA5干扰序列已经完全插入GV493载体中。3种慢病毒载体分别命名为：ITGA5-RNAi-1，ITGA5-RNAi-2，ITGA5-RNAi-3。

ITGA5-RNAi-1的滴度为3E+9TU/mL，ITGA5-RNAi-2的滴度为4E+9TU/mL，ITGA5-RNAi-3的滴度为4E+9TU/mL。

1.6 稳定感染细胞系的干扰效果鉴定

1.6.1 qPCR检测稳定感染细胞系中的mRNA水平 培养稳定感染的Bel-7404细胞系、NC对照组及空白对照组细胞，待各组细胞密度为80%～90%时，弃去培养液，用冰PBS洗3次，按Trizol说明书提取总RNA。根据ITGA5基因序列设计qPCR反应引物，使用逆转录试剂盒合成基因的cDNA，按照 Bestar SybrGreen qPCR mastermix试剂说明书配制成20 μL的qPCR反应体系，采用95℃ 2min（预变性），95℃ 10s、55℃ 30s、72℃ 30s（PCR，40个循环），55℃1min（退火）进行 PCR 反应。实验重复3次。根据实时荧光定量PCR结果中 Ct值分析 mRNA 的表达量 F，F=2-△△Ct，△△Ct=（待测样品的目的基因的Ct平均值-待测样本的内参基因的Ct平均值）-（对照样品的目的基因的Ct平均值-对照样本的内参基因的Ct平均值）。根据不同样本的表达量计算干扰效率（干扰效率=NC对照组表达量/（NC对照组表达量-干扰组表达量）。

2.4.1 qPCR结果 阴性对照组mRNA相对表达量接近 100%，ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组的mRNA相对表达量分别为：（10.7±3.7）%、（16.7±1.5）%、（11.8±2.9）%，3 个实验组的干扰效率分别为：90%、85%和89%，可以看出3个干扰组的干扰效率均＞70%，可任意选择其中一个靶点用于后续实验，见图4。

1.7 统计学方法

（2）伊利石在半风化层开始出现，并且贯穿半风化层、全风化层、表土层；石英和针叶矿贯穿整个剖面；埃洛石在全风化层含量较高，往上逐渐被高岭石替代。

2 结果

2.1 ITGA5-RNAi慢病毒载体的构建及序列测定

将浓度为4×104个/mL的BEL-7404细胞悬液2mL接种于6孔板中培养，同时设立未处理组。待细胞融合度为20%～30%，弃去培养基，加入含病毒（慢病毒体积=MOI×细胞数/病毒滴度，其中MOI经预实验确定为20）的培养基1mL，12h后更换新鲜DMEM完全培养基。72h以后观察GFP的表达情况，同时加入浓度为1μg·mL-1 puromycin（经预实验确定的最佳浓度）进行筛选，每隔2d更换含puromycin的新鲜培养基。待未处理组细胞全部死亡后，继续用含puromycin的培养基培养病毒感染组细胞1周，直至细胞不再死亡后扩增存活细胞，获得稳定感染的细胞系。

2.2 ITGA5-RNAi慢病毒载体的滴度测定结果

  

图1 GV493载体的结构图

  

图2 重组质粒载体GV493-ITGA5-shRNA测序鉴定

党的十九大报告明确提出实施乡村振兴战略，就不断深化农村改革、加快建设现代农业、加强农业农村基础工作等作出总体安排。今年中央“一号文件”对实施乡村振兴战略作出系统部署，其中加强农村产权保护、突出环境问题综合治理、建设法治乡村、平安乡村等诸多工作，与人民法院审判工作有着紧密的联系，同时也对人民法院工作提出了新的、更高的要求。今年2月，最高人民法院就贯彻落实《中共中央、国务院关于实施乡村振兴战略的意见》作出具体安排部署，要求人民法院充分认识乡村振兴战略的重大意义，积极贯彻落实中央精神，依法保障乡村振兴战略实施。

2.3 稳定感染Bel-7404细胞的筛选及构建细胞系

用筛选出的病毒感染Bel-7404细胞，72h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，加puromycin筛选1周后，荧光显微镜下有近100%的细胞呈现出绿色荧光（图3），表明ITGA5的干扰序列及GFP基因已经整合到目的细胞中，稳定感染的细胞系构建成功。

2.4 qPCR和Western blot对稳定感染细胞系的干扰效果鉴定

1.6.2 Western blot检测稳定感染细胞系中的蛋白质水平 收集稳定感染的ITGA5-RNAi-1组、ITGA5-RNAi-2组、ITGA5-RNAi-3组、NC对照组和空白对照组Bel-7404细胞，使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法检测其浓度。用PBS统一各组蛋白质量浓度，加入上样Buffer，90℃变性10min。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，等体积（10μL）、等浓度（4μg·mL-1）上样后 80V 电泳40min，后改为100V至电泳完毕，300mA恒定电流转膜2h，PBS洗膜1min，用5%脱脂奶粉室温下封闭1h。用抗Integrinα 5兔单克隆抗体（浓度1∶3000）4℃孵育过夜，山羊抗兔二抗（浓度1∶5000）在室温下孵育1h，PBST洗膜10min×3次。ECL显影剂曝光，使用Gel-Pro analyzer软件分析蛋白质条带的灰度值（蛋白条带的相对表达量=蛋白条带灰度测定值/相应内参条带的灰度测定值）。

  

图3 荧光显微镜观察各组慢病毒感染Bel-7404细胞的GFP表达（×20）

  

图4 qPCR检测ITGA5mRNA在各组肝癌细胞Bel-7404的表达

2.4.2 Western blot检测结果 用蛋白灰度分析软件分析各组细胞的蛋白的相对表达量（n=3，x±s），未处理组（100±0.6）%与阴性对照组（96.4±0.4）%的整合素α5蛋白表达水平差异无统计学意义（P=0.28）。3种慢病毒干扰组与阴性对照组相比整合素α5蛋白的表达水平均下降（P=0.00）。结合qPCR结果提示，3种ITGA5慢病毒干扰载体均有很好的干扰效果，敲减ITGA5基因表达的Bel-7404肝癌稳转细胞系建立成功，见图5。

计量资料以均数±标准差（x±s）表示。使用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，实验分组的总体均数比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），各组间两两比较采用多重比较的最小显著法（LSD-t）检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

  

图5 Western blot检测ITGA5蛋白在各组Bel-7404细胞中的表达

整合素是一种跨膜蛋白，连接细胞外基质和细胞内骨架，在1986年被Tamkun等定义为整合素[15]。它由α和β两个亚单位组成，迄今已发现由18种α和8种β亚基以不同形式组合可形成24种整合素二聚体，其包括胞外结构域、跨膜结构域和胞质域。其中，整合素胞质域可能直接与细胞骨架蛋白和细胞内信号分子连接，调节细胞黏附、增殖、迁移和存活[8]。近年来，发现整合素在很多方面调节肝癌的侵袭和转移，包括细胞黏附、侵袭和迁移[3]。前期研究表明，整合素α5在肝癌组织中的表达高于癌旁组织并且与肝癌的TNM分期和肿瘤转移有关，其可能成为肝细胞癌的预后标志物和潜在的基因治疗靶点[16]。其他研究还发现，ITGA5在MicroRNA的调控下促进肝癌细胞失巢凋亡[10]。选择何种整合素和靶向药物取决于对整合素生物学功能更好的理解，本研究中主要针对ITGA5构建了RNAi慢病毒表达载体，为进一步研究ITGA5在肝癌中的生物学功能及其所参与的作用机制奠定研究基础。

RNAi是基因的一种保守的调控机制，采用非编码小RNA介导转录或者转录后基因沉默。细胞中dsRNA被Dicer酶切成siRNA后，siRNA解旋后与细胞内的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），RISC与其互补的转录产物结合，引起RNA发生特异性降解。慢病毒载体具有高感染性和高表达性，利用其将RNAi片段导入宿主细胞，可以使目的基因持续而且稳定沉默[17-18]。本研究设计了3对针对ITGA5基因的RNAi靶点序列，并成功构建了3种ITGA5-shRNA慢病毒表达载体，分别将其和质粒共转染HEK-293T细胞后获得病毒上清。病毒感染目的细胞Bel-7404细胞后，用puromycin对细胞进行筛选实验，在荧光显微镜下分别观察ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3、阴性对照组中均可见明显的绿色荧光，表明病毒高效感染目的细胞，并表达GFP。经Western blot、qPCR检测结果显 示 ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组的蛋白和mRNA均低于阴性对照组，3组的干扰效率均达80%以上。本实验中成功构建了3种稳定沉默ITGA5的Bel-7404细胞系，可选择其中一株细胞系作为后续研究的工具细胞。

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