真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)是由致病真菌引起的感染性角膜病变，是一种致盲性眼病[1]。FK的主要病理特点是出现大量的吞噬细胞和明显的炎症反应，其角膜病理损害除了由病原体引起外，机体的炎症反应也起着重要的作用。多西环素是常见的四环素类抗生素。研究表明，多西环素可通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的生成及活性，产生抗炎作用[2]。本研究通过建立大鼠烟曲霉菌性角膜炎模型，观察多西环素对单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表达的影响，探索多西环素对大鼠FK的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级SD雌性大鼠64只，体重220～250 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002，动物使用许可证号：SYXK桂2014-0003。实验前裂隙灯检查排除眼前节疾病。随机分为对照组和多西环素组，每组32只，建模后对照组给予眼液溶媒点眼，多西环素组给予0.3 g/L多西环素眼液点眼。眼液溶媒中不含多西环素，其余成分与0.3 g/L多西环素眼液相同。

其次，鉴别猪流行性感冒。该病具有非常快的传播速度，多表现为突然发生，不同年龄的猪均会患有该病，发病后病猪的体温上升明显，但是总体较短，比较猪气喘病可知气喘病发生后传播速度略慢，体温较为稳定，基本在出现继发感染后病猪体温会出现升高，患病时间稍长。

1.2 标准菌株

烟曲霉菌菌种(Aspergillus Fumigutus，AF)，编号3.0772，购于中国科学院微生物研究所菌种保存中心。将菌株接种于Sabouroud培养基，于25 ℃温箱中培养1周后，以灭菌水制成真菌孢子混悬液，血细胞计数板计数，并调整孢子浓度为1×108CFU/mL[3]。

1.2.1 乙醇与不同种类无机盐相图的绘制和分相能力对比 试验显示,氯化钠不能与无水乙醇形成稳定的双水相，磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸铵、碳酸钠都能与乙醇形成稳定的双水相体系.室温下,通过改变盐的用量,采用浊点法绘制各双水相体系相图,如图1所示.

1.3 主要仪器和试剂

引物由宝生物(大连)有限公司合成。MCP-1上游：5’-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3’，下游：5’-CAGCCGACTCATTGGGATCA-3’，扩增产物长度146 bp；β-actin上游：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’，扩增产物长度150 bp。

1.4 大鼠FK模型的建立

应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，呈偏态分布资料以中位数(M)表示，组间比较采用秩和检验；呈正态分布的计量资料以均数±标准差)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 观察指标

1.5.1 炎症指数 术后第3、第5、第7、第10天，于裂隙灯下观察大鼠病灶大小、病变深度和前房情况等，计算炎症指数。炎症指数按以下标准评分[4-5]：(1)病灶大小：1分，病灶累及角膜总面积1%～25%；2分，病灶及角膜总面积26%～50%；3分，病灶累及角膜总面积51%～75%；4分，病灶累及角膜总面积76%～100%。(2)病变深度：1分，角膜轻度混浊，瞳孔及虹膜清楚可见；2分，角膜浅层灰白色混浊，瞳孔及虹膜透过病灶可见；3分，角膜全层不透明，不均匀混浊；4分，均匀致密混浊。(3)角膜新生血管形成：1分，角膜缘可见少量新生血管；2分，新生血管向角膜中央生长面积小于50%；3分，新生血管向角膜中央生长面积大于50%。(4)有下列症状的加上相应的得分：1分，前房积脓；2分，眼前房出血；3分，后弹力膜膨出；4分，角膜穿孔。

1.5.2 炎症细胞计数 术后第3、第5、第7、第10天，随机选取4只大鼠处死，用无菌手术器械沿角膜缘快速取下角膜，一部分置于液氮中冻存，分别用于荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测；一部分用4%中性甲醛固定，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，按角膜的最大径线4 μm连续切片，经烤片脱蜡后，行苏木精—伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和过碘酸—Schiff(periodic acid schiff，PAS)染色，中性树胶封片，光镜下观察。于400倍镜下记录各时间点切片中角膜周边部、中周部及角膜中央共5个视野，通过Image J软件进行炎症细胞计数。

1.5.3 qPCR检测MCP-1基因表达 提取角膜组织总RNA，逆转录成cDNA，进行qPCR反应，SYBR反应体系：共20 μL，含TaqDNA聚合酶10 μL、dH2O 6.4 μL、上游和下游引物各0.8 μL、模板cDNA 2 μL。反应条件：第一步，95 ℃ 30 s；第二步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；添加熔解曲线。使用Sequence Detection software version 1.2.3软件(美国AB公司)记录Ct值，以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

显微手术器械(上海医疗器械)；显微镜(日本Olympus公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；全功能微孔板检测仪(美国BioTek公司)；Real-Time PCR仪(美国AB公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美公司)；RNA提取试剂(美国Axygen公司)；RNA逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；多西环素(美国Sigma公司)。

1.5.4 ELISA法检测MCP-1蛋白水平 取角膜标本，称重，加入磷酸盐缓冲液后充分将角膜组织均质化，4 ℃高速离心5 min，取上清，BCA法测总蛋白浓度。ELISA检测按照试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(OD)值，通过Curve Expert 1.4软件制作标准曲线，计算MCP-1蛋白浓度(结果以MCP-1蛋白浓度与标本总蛋白浓度的比值表示)。

1.6 统计学方法

模型制备前用0.5%左氧氟沙星滴眼液滴大鼠双眼，4次/d，共3 d。按3.5 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛全麻后，1%盐酸丁卡因滴术眼，常规消毒，用4 mm环钻在角膜中央定位，刮除角膜上皮，覆盖上直径为6 mm软性角膜接触镜(环钻刻切)，镜片与角膜层间注入1×108 CFU/mL孢子混悬液，结膜囊涂氧氟沙星眼膏，5-0丝线缝合上下眼睑。术后9 h 拆线，移除角膜接触镜。

2 结 果

2.1 两组大鼠角膜炎症指数比较

其次，会计信息化依靠着网络系统来运行，一旦系统出现故障问题，企业的财务信息和数据便会泄露，使得企业面临着严重的经营风险，降低企业的经营效益。所以企业应当针对财务系统建立起全面地监查制度，实施对于财务系统设备的管理与监控工作，形成系统化、规范化的信息数据处理工作，提高企业财务信息数据的安全性。

2.2 两组术后各时间点大鼠角膜炎症细胞的变化

大鼠烟曲霉菌感染后第3、第5、第7天，多西环素组MCP-1 mRNA相对表达量和蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)，见表3。

MCP-1为CC趋化因子家族中重要成员之一，当机体发生炎症反应时，角膜基质层、血管内皮细胞、成纤维细胞等产生MCP-1，是机体重要的促炎症细胞因子[7]；作为主要的巨噬细胞趋化因子，又在巨噬细胞的浸润中起重要作用[8]。Lee等[9]研究发现，在单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)小鼠模型中，MCP-1的表达升高，并且基因敲除MCP-1后，小鼠角膜CD4+ T细胞的浸润明显减少，说明MCP-1可以触发CD4+ T细胞迁移到HSV-1感染的角膜基质引起免疫反应，从而导致角膜组织的破坏。由细菌、真菌、棘阿米巴等病原体引起的感染性角膜炎中，均可以检测到MCP-1的表达量明显升高，而在大鼠FK的早期免疫反应中，Dectin-1可能通过IL-1β、IL-6以及MCP-1等来招募中性粒细胞和巨噬细胞来参与抗真菌免疫反应[10-11]。MCP-1在FK的炎症损害中可能起着重要的作用。

2.3 两组大鼠角膜MCP-1表达变化

HE染色结果：正常角膜上皮完整，胶原纤维排列规则，有极少量的炎症细胞；术后第3天对照组角膜浅层基质坏死脱落，溃疡形成，大量的炎症细胞浸润，见图2；术后第5天，角膜基质纤维疏松，炎症细胞达到高峰；术后第7天，炎症细胞减少，角膜上皮逐渐修复，新生血管长入。PAS染色结果显示：术后第3天，见大量的菌丝，第5天后病灶内可见数根菌丝或未见菌丝。与对照组相比，多西环素组术后各时间点炎症细胞计数显著减少(P<0.05)，见表2。

  

 

图1 对照组术后第3天可见角膜中央致密白色混浊

 

表1 两组术后各时间点角膜炎症指数比较(M)

  

组别第3天第5天第7天第10天对照组6 008 0010 0011 00多西环素组4 006 508 0010 00u-2 29-2 10-2 38-1 42P0 020 030 020 15

  

A：多西环素组；B：对照组。图2 接种后第3天角膜炎症细胞变化(HE，×400)

 

表2 两组术后各时间点角膜炎症细胞计数(个，

  

项目第3天第5天第7天第10天对照组90 00±17 13370 00±29 70208 40±44 48132 60±29 91多西环素组59 40±13 24132 20±23 3591 60±5 5572 00±14 71t3 1614 115 834 06P0 01<0 01<0 01<0 01

 

表3 两组MCP-1 mRNA相对表达量以及蛋白水平比较

  

时间点MCP⁃1mRNAMCP⁃1/(μg/g)对照组多西环素组对照组多西环素组第3天0 97±0 350 43±0 10#0 56±0 130 24±0 03#第5天1 49±0 290 91±0 30#0 17±0 400 10±0 02#第7天1 36±0 080 69±0 31#0 13±0 260 07±0 02#第10天1 06±0 370 57±0 270 05±0 020 04±0 01

与对照组同一时间点相比，#P<0.05。

3 讨 论

在正常情况下，角膜的保护是通过正常的泪膜生理活动和完整的解剖屏障来实现的，这些屏障阻止真菌有效地结合和侵袭。当这些屏障被破坏时，真菌病原体能够附着在角膜上，释放有毒的代谢产物，浸润并破坏角膜组织[6]，同时在病原菌和宿主诱导的炎症细胞和趋化因子MCP-1、巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)、白介素-8(IL-8)等作用下启动免疫应答反应。固有免疫作为机体抵抗真菌感染的第一道防线，前提是实现宿主对病原微生物的免疫识别。角膜上皮、结膜上皮、巨噬细胞等可表达多种模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，PRRs与真菌病原体相关模式识别分子(pathogen agsociated molecular patterns，PAMP)相互识别发生配体—受体反应，主要是依赖MyD88的信号途径及非MyD88依赖途径引起胞内信号传导，最终解除对核因子κB(nuclear factor kappa b,NF-κB)的限制，NF-κB进入细胞核启动核内相关基因的转录和表达，产生的细胞因子趋化和募集更多的炎症细胞的浸润。抗原递呈细胞是固有免疫和适应性免疫间的重要桥梁，包括树突状细胞和巨噬细胞等。识别后的真菌经抗原递呈细胞将抗原递呈给CD8+ 、CD4+等，诱导机体产生Th1型和Th2型免疫细胞，从而启动获得性免疫。其所激发的过强的免疫性炎症是角膜炎病理损害的重要因素。临床上常常可以观察到，有些病例经过积极抗真菌治疗后反复检查已经找不到真菌，但是角膜炎症仍然持续进展，出现角膜组织坏死溶解，甚至角膜穿孔。因此，控制机体过强的炎症反应在FK中起着重要的作用。

术后9 h移除角膜接触镜，可见对照组结膜轻度充血，角膜水肿，接种部位出现白色混浊；第3天，角膜表面菌丝苔被覆盖(图1)；第5天，角膜溃疡灶开始缩小，部分可出现前房出血或角膜后弹力膜膨出，第7天后角膜溃疡灶进一步缩小，形成角膜白斑或有新生血管爬入角膜缘。与对照组相比，多西环素组术后第3、第5、第7天炎症指数明显降低(P<0.05)，见表1。

学生、教材、教师是构成课堂教学的三大基本要素。学生是接受教育的对象，教材是用以开展教育教学的载体，教师则是借助教材向学生进行教学活动的组织者。从一定意义上说，教师的主观能动作用决定着课堂教学效益的高低，因此，应立足课堂教学，促进教师专业能力的发展。

多西环素是一种多效性抗生素，具有抗炎和免疫调节作用。Lindeman等[2]研究指出，多西环素能选择性地作用于血管炎症，并且有效减少人腹主动脉瘤管壁中的中性粒细胞和细胞毒性T细胞数量，通过减少氧化应激反应、抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/Akt信号通路从而抑制MMP的活性[12]；用多西环素刺激人类肺上皮细胞能使MCP-1的产生减少95%，单核细胞的趋化能力减少55%[13]。多西环素在眼科中也有一定的应用和研究。有研究表明，多西环素可抑制体外培养的人结膜上皮细胞和角膜上皮细胞IL-1β等炎性因子的表达[14-15]；对角膜血管化的患者局部使用多西环素可以有效减少新生血管形成和促进角膜上皮的愈合[16]，多西环素具有较强的抗炎作用。

本研究中，对照组第3天角膜组织出现炎症细胞浸润，第7天达到高峰，随后逐渐减少；MCP-1在感染后呈显著高表达，在第7天达到高峰，随后逐渐下降，与炎症细胞浸润的趋势基本一致。而在多西环素的干预作用下，各时间点的炎症指数和炎症细胞数减少、角膜MCP-1的表达降低。这提示多西环素可以抑制大鼠烟曲霉菌性角膜炎中炎症细胞的浸润以及MCP-1的表达。本组前期研究发现，多西环素可抑制碱烧伤大鼠角膜组织中NF-κB的活化，从而可能促进炎症细胞的凋亡[17]。本实验针对大鼠FK中主要的炎症细胞以及MCP-1进行研究，认为多西环素可能是通过抑制MCP-1的表达而减少对炎症细胞的趋化作用，或通过抑制NF-κB的活化，减少MCP-1的相关基因的表达，诱导炎症细胞的凋亡，从而减轻眼表炎症。后期本组将对NF-κB在FK中的作用进行研究，以进一步探索多西环素对FK的具体抗炎作用。

综上，多西环素可以减少FK大鼠角膜炎症细胞的浸润、下调MCP-1的表达，其机制可能与抑制FK角膜炎症反应有关。

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参考文献：

[1] KALKANCI A,OZDEK S.Ocular fungal infections[J].Current Eye Research，2011，36(3):179-189.

[2] LINDEMAN J H,ABDUL-HUSSIEN H,VAN BOCKEL J H,et al.Clinical trial of doxycycline for matrix metalloproteinase-9 inhibition in patients with an abdominal aneurysm: doxycycline selectively depletes aortic wall neutrophils and cytotoxic T cells[J]. Circulation，2009，119(16):2209-2216.

[3] 刘 廷,徐园园,陈 豪,等.改良角膜表面镜片术法建立兔曲霉菌性角膜炎动物模型[J].中华实验眼科杂志，2011，29(2):101-106.

[4] WU T G, WILHELMUS K R, MITCHELL B M. Experimental keratomycosis in a mouse model[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2003，44(1):210-216.

[5] OZTURK F, YAVAS G F, KUSBECI T, et al. Efficacy of topical caspofungin in experimental fusarium keratitis[J]. Cornea，2007，26(6):726-728.

[6] DONG X, SHI W, ZENG Q, et al. Roles of adherence and matrix metalloproteinases in growth patterns of fungal pathogens in cornea[J]. Curr Eye Res，2005，30(8):613-620.

[7] AZHER T N, YIN X T, STUART P M. Understanding the role of chemokines and cytokines in experimental models of herpes simplex keratitis[J]. J Immunol Res，2017，2017(1):1-5.

[8] VOHR H W. Monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1)[J]. Cytokine，2016，60(1):1-12.

[9] LEE S K, CHOI B K, KANG W J, et al. MCP-1 derived from stromal keratocyte induces corneal infiltration of CD4+ T cells in herpetic stromal keratitis[J]. Molecules & Cells，2008，26(1):67.

[10] HORI S, SHOJI J, INADA N, et al. Evaluation of chemokines in tears of patients with infectious keratitis[J]. Nippon Ganka Gakkai Zasshi，2013，117(2):117-125.

[11] XU Q, ZHAO G, LIN J, et al. Role of Dectin-1 in the innate immune response of rat corneal epithelial cells to Aspergillus fumigatus[J]. Bmc Ophthalmology，2015，15(1):1-7.

[12] YU M, CHEN C, CAO Y, et al. Inhibitory effects of doxycycline on the onset and progression of abdominal aortic aneurysm and its related mechanisms[J]. European Journal of Pharmacology，2017，811

[13] RAZA M, BALLERING J G, HAYDEN J M,et al.Doxycycline decreases monocyte chemoattractant protein-1 in human lung epithelial cells[J]. Experimental Lung Research，2006，32(1-2):15-26.

[14] 肖启国,刘祖国,张 梅,等.多西环素对培养的人结膜上皮细胞炎性反应及凋亡的影响[J].中华眼科杂志，2005，41(9):842-846.

[15] SOLOMON A, ROSENBLATT M, LI D, et al. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium[J]. American Journal of Ophthalmology，2000，130(5):2544-2557.

[16] JOVANOVIC V, NIKOLIC L. The effect of topical doxycycline on corneal neovascularization[J]. Current Eye Research，2014，39(2):142-148.

[17] 付馨余,邹文进,黄明汉,等.多西环素对碱烧伤大鼠角膜组织中NF-κB和bcl-2表达的影响[J].眼科新进展，2014，33(10):915-917.