骨癌痛作为恶性肿瘤患者最常见的症状严重影响患者的生活质量。阿片类药物是癌痛治疗的常用药物，但在连续用药停药后会引起痛觉过敏和药物耐受[1]。有国外文献[2]报道称：吗啡治疗疼痛一段时间后会诱发持续的痛觉敏化，一直持续到吗啡停用后几个月，其发生和维持主要依赖于脊髓NLRP3炎症小体的活化。因此，本研究拟在骨癌痛大鼠模型上制备吗啡耐受模型,通过测定脊髓NLRP3炎症小体和IL-1β的变化，来探讨其在骨癌痛吗啡耐受形成中的作用，并探究鞘内注射Anti-NLRP3对大鼠痛觉敏化的影响。

猪瘟，俗称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病，此病的分布范围广，病死率高，对养猪业的威胁很大。猪瘟病毒是一种泛嗜性病毒，遍布在病害猪的各种组织中，脾脏、淋巴结、红骨髓等组织中的含量较高。猪瘟病毒对外界环境的抵抗力较强，含有猪瘟病毒的猪肉即使储存几个月也会有传染性。猪瘟病毒不耐干燥，对2%～4%的氢氧化钠溶液比较敏感，尤其是温度较高的消毒液，效果更好。

1 材料与方法

1.1 药品与设备

盐酸吗啡注射液(东北制药集团)；兔多克隆抗体toNLRP3(ab214185)、山羊抗兔H&L(HRP)(ab205718)、兔IgG，多克隆抗体-同型对照(ab171870)，均购自英国abcam公司；walker256乳腺癌细胞株(北京市肿瘤防治研究所提供)；电子VonFrey测痛仪(北京中昊万通公司)。

1.2 动物选择及分组

清洁级健康成年雌性SD大鼠，体重180～230 g，北大肿瘤医院实验动物中心提供。室温饲养，自由摄食水。参照文献[3]介绍的方法给大鼠行鞘内置管术，选择大鼠L5～6椎间隙，与脊柱成60～80°方向进针，若大鼠出现甩尾或后肢抽动表明穿刺成功，可见脑脊液流出。选择成功置管的大鼠50只随机平分为5组，S组、P组、PM组、PMG组、PMA组。

1.3 骨癌痛模型和骨癌痛-吗啡耐受模型的建立与给药

腹腔内注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠后，取仰卧位固定，右侧后肢消毒，于胫骨中上1/3处做一切口暴露胫骨，用20 μl注射器抽取5 μl(1×105个/μL)Walker 256肿瘤细胞缓慢注入，S组注入等体积生理盐水。注射完毕后用无菌骨蜡封堵针孔，清创缝合。术毕将大鼠放回笼中恒温饲养，昼夜交替。

与S组比较，P组T1-6时，PM组、PMG组、PMA组T1和T4-6时大鼠机械痛阈降低(P<0.05)；与P组相比，PM、PMG组T2-3时机械痛阈升高，T4-6时下降，PMA组机械痛阈T2-3时升高，T4-5时下降，T6时升高(P<0.05)；与PM组和PMG组比较，PMA组T5-6时机械痛阈升高(P<0.05)，见表2。

真之本质随着柏拉图思想而发生的转变不是历史上的某个过去了的偶然事件，而是形而上学历史的命运。海德格尔深入柏拉图的洞穴比喻，揭示那未被道说的转变，不是为了按照idea的指示去思考Aletheia，而是想要打开某种契机，使我们可以“更为开端性地”思考“真之开端性的本质”，“因为，有待建基的东西，即无蔽本身的本质，在这里还根本没有得到充分追问。在此始终只是对未曾被把握的无蔽之本质的一个本质后果的‘说明’而已。”[5]238

2015年10月，盛通印刷参股一家从事教育出版策划和发展的公司；2016年4月发布重大资产重组草案，拟用4.3亿元人民币并购少儿机器人教育公司——乐博乐博，致力于4～12岁青少年思维模式及动手能力方面的教育。通过几次参股和并购，盛通印刷悄然完成了业务的大转型，未来的市场格局更加清晰。

[2] GRACE P M,STRAND K A,GALER E L,et al.Morphine paradoxically prolongs neuropathic pain in rats by amplifying spinal NLRP3 inflammasome activation [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(24):3441-3450.

1.4 行为学测定

选取造模前1 d、造模第7、14、20、21、23、27 d(T0-6)作为时间点对大鼠进行行为学测定。行走痛评分标准如下：0分:行动正常，手术肢无跛行;1分:手术侧后肢行走时轻微跛行;2分:手术侧后肢中度跛行，介于1～3分;3分,:手术侧后肢高抬，跛行严重;4分:手术侧后肢完全运动，不能着地。

[4] 阎雪彬,黄晓玲,黄东.NMDA受体和NOS参与骨癌痛小鼠吗啡耐受的形成 [J].中南大学学报(医学版),2010(5):458-463.

丽江市位于云南省西北部云贵高原与青藏高原的连接部位，地势起伏较大，山区、平坝、河谷并存。全市总面积21219平方公里，其中山区占总面积的92.3%，高原坝区占7.7%，总耕地面积为158万亩，其中水田面积40万亩。近几年来，随着城镇化进程的加快，农村劳动力快速转移，加之农业产业结构的调整，水稻种植面积逐年减少，从2012年的28万亩减少到2017年的21.3万亩，严重影响了主要粮食作物的可持续发展。为了稳定粮食生产，减轻农民劳动强度，提高劳动生产率，全面加快水稻全程机械化发展已迫在眉睫。

1.5 蛋白质印迹法检测NLRP3蛋白的表达

第27 d痛行为学测定结束后处死大鼠，各组取5只大鼠，剥离其脊髓组织，匀浆后冰上裂解，离心，取上清液，测定蛋白浓度，取30 ug蛋白变性、上样。配制凝胶，电泳转膜，转膜后用脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗NLRP3一抗，4 ℃孵育过夜。再次洗膜后加入山羊抗兔二抗，室温下孵育1 h。用ECL化学发光法显色后收集图像进行分析，通过目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度值的比值来反映NLEP3蛋白的表达情况。

1.6 ELISA法测定脊髓IL-1β的含量

取各组剩下的5只大鼠，剥离其脊髓组织，稀释离心后取上清液，按照试剂盒的说明书操作，用酶联免疫吸附法测定脊髓组织中IL-1β的含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自由行走痛评分

与S组对比，P组T2-6时，PM组和PMG组T4-6时，PMA组T4-5时行走痛评分升高(P<0.05)；与P组比较，PM组和PMG组T2-3时行走痛评分降低，T4-6时升高，PMA组T2-3时行走痛评分降低，T4-5时升高，T6时降低(P<0.05)；与PM组和PMG组对比，PMA组T5-6时行走痛评分降低(P<0.05)，见表1。

 

表1 五组大鼠不同时点自由行走痛评分情况 分

  

组别T0T1T2T3T4T5T6S0.00±0.000.24±0.020.20±0.420.0±0.00.0±0.00.00±0.000.00±0.00P0.00±0.000.22±0.011.20±1.03a1.9±0.99a0.10±0.10a2.1±0.85a2.8±1.03aPM0.00±0.000.21±0.010.20±0.42b1.3±0.33b2.8±0.92ab3.4±0.99ab3.6±0.95abPMG0.00±0.000.23±0.220.30±0.43b1.28±0.32b2.5±0.71ab3.5±0.99ab3.7±0.95abPMA0.00±0.000.22±0.420.30±0.48b1.31±0.59b2.7±0.68ab2.9±0.47abcd1.02±0.00bcd

注：与S组相比较，aP<0.05；与P组比较，bP<0.05；与PM组比较，cP<0.05；与PMG组比较，dP<0.05。

2.2 机械刺激缩足反射阈

结合卫星定位技术、信号检测与处理技术、多模通信技术和网络技术，研究了集装箱实时监测的卫星定位、分布式环境监测、安全保障和多模通信等技术方案，设计实现了一种集装箱远程实时安全监测系统。实验测试结果表明，利用相关技术方案搭建的集装箱远程实时安全监测系统功能完善，能够对集装箱在运输过程中的安全状态、位置信息、箱内环境进行远程实时监测，不足之处在未对系统的功耗进行严格的测量和控制，如果能结合低功耗设计、电源管理和新能源发电等技术手段实现系统的长时间工作，则具有一定的应用推广前景，有助于促进集装箱物流运输行业的发展。

从表2的数据统计来看：游览次数分布比较平均，占比最多的是2次，占35.03%。游览时间最多的是周末和自由时间，均占比39.25%。游览目的首要的是陪伴小朋友及家人，占比53.7%；其次是休闲放松、舒缓压力，占比37.85%。信息获取渠道主要通过熟人介绍、网络信息、旅游宣传册和电视广告，四项合计占比87.45%。

2.3 蛋白质印迹法测定和ELISA测定

本研究参照姚明等[10]介绍的方法建立胫骨骨癌痛模型，从第14 d起连续7 d注射吗啡建立骨癌痛吗啡耐受模型。于第21 d时，五组大鼠皮下注射吗啡3 mg/kg，与P组比较，PM组和PMG组在T4-6时PWMT降低，自由行走痛评分升高，提示大鼠吗啡耐受时产生了痛觉敏化，并且发生痛觉敏化的PM组和PMG组大鼠NLRP3蛋白和IL-1β表达较P组升高，提示骨癌痛大鼠吗啡耐受的产生与NLRP3炎性小体和IL—1β相关。给PMA组大鼠鞘内注射Anti-NLRP3后，与PM组和PMG组比较，PMA组大鼠T5-6时机械痛阈升高，自由行走痛评分降低，NLRP3蛋白和IL-1β的表达增加，表明鞘内注射Anti-NLRP3可以缓解骨癌痛大鼠吗啡耐受产生的痛觉敏化，其可能是通过抑制脊髓NLRP3炎性小体的活化，减少炎症介质IL-1β的释放来实现的。

 

表2 不同时点五组大鼠PWMT情况 g

  

组别T0T1T2T3T4T5T6S39.43±3.1830.01±2.0941.09±5.428.07±3.3841.63±4.7539.84±4.7541.31±7.64P40.83±2.7622.23±1.51a20.84±1.97a17.75±1.26a38.5±3.8a19.42±2.00a19.12±1.95aPM39.84±2.721.19±1.68a39.22±4.04b25.91±2.51b16.09±3.19ab11.66±0.8ab11.60±1.59abPMG40.47±2.1820.6±2.04a39.38±2.39b25.77±2.66b14.85±1.1ab11.77±1.24ab11.77±3.1abPMA40.72±4.7621.88±1.73a39.34±2.18b27.12±4.25b15.09±1.65ab16.83±1.19abcd32.25±5.89abcd

注：与S组比较，aP<0.05，与P组比较，bP<0.05，与PM组比较，cP<0.05，与PMG组比较，dP<0.05。

 

表3 五组大鼠脊髓IL-1及NLRP3相关蛋白表达情况

  

组别IL-1β(pg/mg)NLRP3蛋白S组53.93±5.950.46±0.02P组92.78±8.75a1.1±0.1aPM组140.27±6.96ab1.54±0.06abPMG组142.21±15.68ab1.62±0.31abPMA组67.6±1.2abcd0.85±0.05abcd

注：与S组比较，aP<0.05；与P组比较；bP<0.05；与PM组比较，cP<0.05；与PMG组相比，dP<0.05。

3 讨论

NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体是一种存在于细胞中的蛋白质复合物，由NLRP3/ASC/pro-caspase-1组成，其通过活化胞内的胱天蛋白酶Caspase-1，促进细胞分泌并释放成熟的IL-1β，是炎症因子IL-1β产生的必要条件[5]。既往研究显示，NLRP3炎症小体与脂类和糖代谢有关[6]，孙勇等[7]的研究表明，NLRP3炎性小体在小胶质细胞介导的炎症反应中起重要作用，而小胶质细胞的活化又是吗啡耐受形成的关键[8]，有报道称NLRP3在吗啡诱导的痛觉敏化中发挥了决定性的作用[9]。

与S组对比，P组、PM组、PMG组、PMA组脊髓NLRP3蛋白和IL-1β表达上调(P<0.05)；与P组相比，PM组、PMG组脊髓NLRP3蛋白和IL-1β表达上调，PMA组NLRP3蛋白和IL-1β表达下调(P<0.05)；与PM组和PMG组对比，PMA组脊髓NLRP3炎性小体相关蛋白表达下调，IL-1β含量降低(P<0.05)，见表3。

数学学习是一个主动的过程，是学生思维能力不断锻炼提升的过程，教师在进行教学过程中，应该多多创造出新的教学方法，让学生在自主探究中获得知识。在进行探究性教学方法的设计时，教师应该注意以学生为本，为提升学生的学习效率，发挥他们的学习主动性为主要设计标准，以此来让学生的主体地位得到保障，最终让他们在思考的过程中提升自己在数学方面的综合能力，为学生进一步学习奠定基础。

综上所述，NLRP3炎性小体和IL—1β与大鼠骨癌痛-吗啡耐受的产生有密切关系。鞘内注射Anti-NLRP3可减轻骨癌痛-吗啡耐受大鼠的痛觉敏化。

参 考 文 献

[1] 李小梅,董艳娟,李慧莉,等.阿片耐受与慢性癌痛的阿片类药物治疗 [J].中国疼痛医学杂志,2012(9):561-565.

PM组、PMG组和PMA组大鼠于接种后的第14 d起皮下注射吗啡，参照文献[4]注射剂量10 mg/kg，2次/天，连续7 d，S组和P组大鼠对应时点皮下注射等体积生理盐水，建立骨癌痛-吗啡耐受模型。第21 d时，五组大鼠皮下注射吗啡3 mg/kg，观察各组大鼠行为学变化，以作为骨癌痛-吗啡耐受模型是否成功的标志。造模后第22 d起，连续5 d给PM组大鼠鞘内注射生理盐水10 μl，PMG组大鼠注射IgG 10μl，PMA组大鼠注射Anti-NLRP3 10μl，1次/天。

[3] 吴世民,张咸伟.大鼠鞘内置管模型的制作 [J].中国现代医生,2008(15):118-119.

机械痛阈评分标准如下：将大鼠置于底部为金属网格的有机玻璃箱内，适应15 min。待其安静后用纤维丝垂直刺激大鼠后肢足底中央，刺激强度从2 g开始并逐渐增强，当大鼠出现缩足反射时，测痛仪数值即为机械痛阈，每只大鼠测5次，取平均值作为大鼠的PWMT。

[5] 刘琦,周星,周联,et al.NLRP3炎症小体在慢性疾病中的研究进展 [J].转化医学电子杂志,2017(3):66-72.

[6] 李金凤,谢笛,何平平，等.NLRP3炎性体与代谢性疾病的研究进展 [J].生物化学与生物物理进展,2014(5):425-434.

[7] 孙勇,张相彤,梁洪生.NLRP3炎性体在脑出血中的研究进展 [J].国际神经病学神经外科学杂志,2017(1):87-91.

[8] 刘微,崔宇,冯鉴强.胶质细胞在吗啡耐受中的作用 [J].中山大学研究生学刊(自然科学、医学版),2006(2):1-6.

[9] PM G,刘文涛.“种瓜得豆,事与愿违”——吗啡通过激活NLRP3炎症小体延长大鼠的神经病理性疼痛 [J].中国疼痛医学杂志,2016(8):581-582.

[10] 姚明,杨建平,王丽娜,et al.腹水传代与体外培养Walker 256癌细胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性 [J].中华医学杂志,2008,88(13):880-884.