药物性肝损伤(DILI)是目前威胁人类健康的一个严峻问题，在欧美国家往往是造成急性肝衰竭的重要原因[1]。对乙酰氨基酚(N-乙酰对氨基苯酚，APAP)已被广泛用作已知在治疗剂量下安全的镇痛和解热药物。然而，APAP过量或高危人群滥用引起的急性肝损伤已成为许多国家DILI的主要病因。一般认为APAP诱导的肝毒性与过量的活性代谢物N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)的形成有关。NAPQI会和细胞内生物活性分子形成一些复合物，诱导氧化应激，线粒体损伤，最终导致细胞非正常死亡[2]。由于最常用于检测急性和慢性肝损伤的血清标志物(如ALT、AST、碱性磷酸酶和总胆红素水平)均存在其缺陷性[3]，因此在DILI预后中缺乏准确而有效的指标。本实验旨在验证DILI模型治疗后的Betacellulin(Btc)血清水平变化，以期为DILI患者预后提供一个新的指标。

资料和方法

一、研究对象

DILI小鼠模型：取体质量20±2 g的清洁级昆明小鼠96只，随机分成8组(雌雄各半，且雄鼠和雌鼠分开饲养)编号1～8，选择第1～5组作为实验组，第6组为备用组，第7、8组为对照组，以200 mg/kg剂量给小鼠APAP溶液灌胃(对照组以200 mg/kg给小鼠灌胃0.9%生理盐水)，染毒12 h后，即为急性DILI模型。在预实验中利用眼眶静脉丛采血分析小鼠血清中ALT、AST及GSTA1活性，可发现此时实验组小鼠血清中3种酶活性显著升高，与空白对照组小鼠血清中的酶活性差异有统计学意义(P<0.05)；肝组织中SOD、GSH含量升高，MDA、NO、GSTA1显著降低(P<0.05)。故可以确定上述条件可成功诱导小鼠DILI模型。

二、仪器与试剂

Mouse Betacellulin/BTC ELISA Kit(货号2904620015，Eton Bioscience公司)购自达科为生物技术有限公司；Trizol reagent(货号15596-026)购自Thermo scientific；逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(货号RR037A)以及定量PCR试剂盒SYBR○R Fast qPCR Mix(货号RR430A)购自Takara公司。全自动样本研磨仪购自上海净信科技(型号Tissuelyser-32)；高速冷冻离心机购自Eppendorf公司(型号Centrifuge 5427R)，ABI QuantstudioTM DX定量PCR仪(货号4479891)购自Life Technologies。

三、标本处理

在小鼠开始发病时(APAP灌胃12 h后)给第1～5组小鼠以100 mg/kg尾静脉注射还原性谷胱甘肽注射液作为治疗剂，后每隔24 h尾静脉注射1次，剂量减半。在小鼠发病的6 h、12 h、24 h、48 h和96 h分别取第1,2,3,4,5组小鼠和两组对照组中的各一对小鼠，利用眼球取血法将血液收集至离心管，1 000 g，4 ℃离心15 min，将血清转移至新的离心管，室温静置4 h后以1 000 g，室温离心15 min，吸取血清并稀释后采用酶联免疫吸附反应法(ELISA)进行血清学Btc活性检测(具体操作步骤见试剂盒说明书)；之后将小鼠解剖，取肝脏小叶，置于液氮储存。其中血清用于ELISA检测(操作按试剂盒说明书)，肝小叶经研磨仪研磨后利用Trizol reagent 提取总RNA，测定浓度后将RNA逆转录为cDNA，借助Taraka SYBR○R Fast qPCR反应系统上机检测Btc mRNA的表达。

今年，74岁的父亲，已是垂垂老矣，他就像一盏快要燃尽的油灯，赡养了四位老人，并把他们一一送走，同时又抚育四个儿女，为了我们的成长，燃尽了自己。

表1 定量PCR引物序列

基因名称引物序列(5'→3')长度(bp)Btc正向引物GAAAACCCACTTCTCTCGGTG94反向引物GCAGGAGGGAGTTTGCTCGGAPDH正向引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT197反向引物GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

结 果

一、小鼠Btc表达检测

(一)小鼠血清Btc活性检测 在得到ELISA实验数据后，首先绘制小鼠Btc标准曲线，回归方程为y=236.09x-13.62，其中y值为样本浓度，x值为OD值。相关系数R2=0.997，符合操作指南中对于相关性的要求(R2>0.99)。在此基础上，分析小鼠不同发病时间其血清中Btc水平，结果如表2，由图中数据可得，小鼠血清中Btc活性在还原性谷胱甘肽注射后与对照组小鼠血清Btc活性相比明显升高，且这种升高持续到注射后24 h(P<0.05)，之后趋于稳定(P>0.01，24 h组与48 h组、96 h组均差异无统计学意义)；对照组小鼠血清Btc则在本底水平保持稳定，其变化差异无统计学意义(P>0.1)。

3)研究方法的使用是否恰当准确对于我们的研究结果具有很大的影响。虽然我们现在的研究也有一定的优势，但是过于单一研究方法也可能会使得我们的研究结论真实性受到质疑。在以后的研究中，我们应该采用多种研究方法进行研究以弥补单个研究方法的不足，从而最大限度地去提高我们研究的准确性。

(二)小鼠Btc在肝组织中的表达水平检测 通过ELISA实验证明在DILI小鼠模型中治疗后一定时间内血清Btc活性持续上升，但无法确定此种上升是否与肝损伤药物治疗之后的肝脏生理及病理状态的变化有关。故在取血后取小鼠的肝小叶，经研磨仪研磨后Trizol法提取RNA，测定在不同条件下小鼠肝细胞Btc mRNA的表达情况。结果如表3所示，对照组小鼠不同时间条件下肝脏中Btc的表达稳定，组别之间差异无统计学意义(P>0.1)，实验组小鼠6 h谷胱甘肽注射后Btc表达量与对照组相比明显升高(P<0.05)，在24 h后表达量趋于稳定，之后的表达变化差异无统计学意义(P>0.1)。

讨 论

Betacellulin中文称β-细胞素，是一类生长因子，能够有效地促进视网膜色素上皮细胞生长和血管平滑肌细胞的再生。Btc具有人鼠保守性，在人和小鼠的肝脏内均有表达。有报道称Btc在肝脏细胞的自我修复和再生过程中发挥重要作用[6]，故我们假设Btc可作为DILI预后的一个指标。

药物对肝脏功能的损伤病例近年来呈高发趋势，在欧美国家DILI已经成为急性肝衰竭的一大诱因，肝损伤已经成为人类健康的潜在威胁，且由于其具体机制现在仍不是非常清晰，故在一定程度上制约了新药的研发。对乙酰氨基酚(APAP)是一类较为广泛使用，在正常的治疗剂量下安全可靠的解热镇痛药，但APAP过量使用会损害肝脏功能，体现为急性或慢性肝损伤。在西方国家APAP的滥用已经成为DILI发病的主要原因[4]。最常用于检测急性和慢性肝损伤的血清标志物是血清丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)和总胆红素水平[5]，但均存在其缺陷性。故在DILI的预后过程中缺乏有效的指标。

表2 谷胱甘肽治疗后小鼠血清中Btc活性变化(±s)

组别6h12h24h48h96h Btc浓度(pg/mL)实验组20.45±0.2536.39±0.3362.96±0.4963.73±0.6160.65±0.51对照组8.47±0.318.02±0.127.85±0.258.45±0.518.21±0.29

表3 谷胱甘肽治疗后不同时间小鼠肝组织Btc mRNA表达

组别6h12h24h48h96hBtc表达量(2-△△cT)实验组12.76±0.3829.49±0.7537.70±0.2653.35±0.6741.89±0.48对照组6.16±0.286.64±0.463.77±0.277.0±0.385.01±0.62

本实验验证利用APAP诱导的小鼠DILI模型，以200 mg/kg剂量给小鼠APAP溶液灌胃，染毒12 h后即成功建立肝损伤模型[8]。在模型成功建立后对实验组小鼠以100 mg/kg尾静脉注射还原性谷胱甘肽作为治疗剂，在注射后6 h，12 h，24 h，48 h和96 h分别检测实验组小鼠的血清Btc活性和肝脏Btc表达，在每个时间节点都取4只(雌雄各半)对照组小鼠作为阴性对照。根据结果，可以看出在还原性谷胱甘肽注射6 h后小鼠血清Btc活性与肝脏Btc表达均已开始上升，且此上升一直持续到第24 h。在24 h后小鼠Btc的血清活性与肝脏表达水平趋于稳定(24 h，48 h和96 h组差异无统计学意义，P>0.1)。由此，我们可以判定在DILI治疗后的恢复过程中，Btc在血清中的活性在一定时间内上升，并稳定在较高水平。同时间节点肝脏组织mRNA的水平与血清Btc活性变化相一致，更是确定此种升高与肝脏组织的自我修复有关，确定了Btc作为DILI预后指标的可靠性。

对于税负的多少来说，不仅受收入和费用的影响，税率也是影响其大小的关键之一。本次个税改革，税率没有变更，但是税率级距增加了(如表2所示)。税率不变，税率级距的增加则会让更多的中低收入者的收入划入税率较低的档，从而减少应纳个人所得税额。

参 考 文 献

[1] Beger RD， Bhattacharyya S, Yang X, et al. Translational biomarkers of acetaminophen-induced acute liver injury. Arch Toxicol, 2015，89: 1497-1522.

[2] Wood PR，Caplan L. Drug-Induced Gastrointestinal and Hepatic Disease Associated with Biologics and Nonbiologic Disease-Modifying Antirheumatic Drugs. Rheum Dis Clin North Am, 2018, 44: 29-43.

[3] McGill MR， Sharpe MR, Williams CD， et al. The mechanism underlying acetaminophen-induced hepatotoxicity in humans and mice involves mitochondrial damage and nuclear DNA fragmentation. J Clin Invest, 2012，122:1574-1583.

[4] Danan G，Teschke R. RUCAM in Drug and Herb Induced Liver Injury: The Update. Int J Mol Sci, 2015, 17. pii: E14.

[5] 高旭东. 药物性肝损伤临床研究及诊断标准探讨. 北京：北京中医药大学,2009.

[6] 李军,白娟,窦科峰,等. β细胞素下调对肝癌细胞增殖能力的影响及其机制探讨. 陕西医学杂志,2016, 45: 643-645, 655.

[7] Li C， Ming Y, Hong W， et al. Comparison of hepatic transcriptome profiling between acute liver injury and acute liver failure induced by acetaminophen in mice. Toxicol Lett, 2018, 283: 69-76.

[8] 周琼. 小鼠急性肝损伤模型的建立及GSTA1分析. 哈尔滨：东北农业大学,2012.