“肺与大肠相表里”理论源于《黄帝内经》，两者之间经脉相络属、生理相协调、病理相影响、功能相关联，历经近现代学者升华，其在中西医结合基础与临床研究上有一定的指导意义。核因子kappa B（nuclear factor of kappa B，NF-Κb）是一种细胞内的重要核转录因子之一，其在人体炎症、免疫、代谢及细胞的增生、转化和凋亡等方面起重要作用而受到学者们广泛关注［1］。本实验通过复制慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型、便秘模型、COPD合并便秘模型，研究NF-κb及其mRNA在肺与结肠组织中的表达水平，探讨该信号通路在“肺与大肠相表里”方面相互影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器 31k 5C型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；数字型可调移液器（20～200μl，法国eppenodorf公司）；KDC-2046型低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司）；Gel Doc1000凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；PROTEAN IEF型双向电泳（美国Bio-Rad公司）；FTC2000实时荧光定量基因扩增仪（Fnuglyn公司）；自制玻璃材质烟熏箱（规格：60 cm×50 cm×40 cm）。

1.1.2 主要试剂 脂多糖（美国Sigma公司，编号：L2880）；鼠抗NF-κBP65抗体、即用型 SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德公司）；DAB显色试剂盒（北京中山公司，编号：PW017）；RNA提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司）；RNA稳定剂RNAlater（德国QIAGEN公司）；real-time PCR试剂盒（美国ABI公司）；实验用烟为黄果树牌香烟（焦油含量为12mg，上海卷烟厂生产）。

1.1.3 实验动物 SD大鼠40只，雌雄各半，清洁级，体质量为150±50 g，均购自中南大学实验动物学部，动物合格证号：SCXK（湘）2013-0009。大鼠饲养于湖南中医药大学动物实验中心，动物饲养室为清洁级，控制温度在20℃左右。

第二，建立国内商事法庭是中国离岸国际商事法庭成功构建的保障。中国国内商事法庭除了负责处理国际商事法庭无法管辖的、涉及“一带一路”建设的案件外，还能成为吸引当事人选择中国国际商事法庭管辖的重要媒介。通过建立以提高审判效率和审判质量为原则，区别于民事审判程序的商事法庭，一方面，中国可以在国内商事法庭中贯彻商法理念，适当维护商业利益，适度支持商业创新，以提升世界对中国商事司法审判的认同感，进而提高中国国际商事法庭的吸引力。另一方面，国内商事法庭还能为中国国际商事法庭的审判提供商事审判经验。

国内也有一些研究：刘诚等（2012）从老乡、校友、共同工作经历衡量独立董事和 CEO 的社会关系，并发现这些关系与董事会的独立性正相关；陆瑶等（2016）重点考察了独立董事与CEO之间的老乡关系对公司违规的影响；李维安等（2017）从董事会成员与CEO之间的老乡、工作、校友关系、年龄和性别相似度度量董事会的社会独立性，发现董事会社会独立性越高，违规公司的CEO越容易发生变更。

1.2 动物分组与模型制备 40只大鼠按随机数字表法分为4组：正常对照组、COPD模型组、便秘模型组、COPD合便秘模型组，每组10只。

1.2.1 COPD模型制备 采用烟熏法联合气管内注射脂多糖法制备COPD大鼠模型［2］。大鼠禁食12 h，用10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉大鼠后固定于实验台上，用碘酒消毒颈部皮肤，逐层分离皮下组织，暴露气管，抬高大鼠头部，用2 ml注射器向气管内注入脂多糖（1 g/L），并左右平旋大鼠10次，以使药物均匀分布于两肺，然后缝合颈部皮肤，进行手术创口消毒后将大鼠放回笼中。采用上述方法分别于第1天和第20天在大鼠气管内各注入脂多糖1次，再将大鼠置于自制熏烟箱中，每日点燃10支香烟（第1、20天除外），上、下午各用烟5支，每间隔5～10 min敲打箱壁1次，使大鼠吸烟量均匀，造模时间为30 d。

1.2.2 便秘模型制备 ［3］ 采用75%次碳酸铋水糊状液灌胃造模。连续4 d给予次碳酸铋水糊状液灌胃，每只10 ml，2次/天，再连续2 d给予同体积的水，重复上述方法3次，造模结束。判断模型成功的标准是大鼠粪便干燥、粒形缩短、排出费力。

1.2.3 COPD合便秘模型制备 采用COPD模型与便秘模型制备方法诱发大鼠COPD和便秘同时出现。

1.3 检测项目与方法 实验结束时，将各组大鼠断颈处死后，取右下肺及结肠组织迅速投入液氮中保存。

凌晨两点多，睡梦中的夫妇被17岁儿子的一声惨叫惊醒。跑过去一看，儿子的胸口竟然插着一把水果刀！情急之下，赶紧拨打120急救电话。很快，120急救人员赶到，将儿子抬上急救车送往医院抢救。多亏抢救及时，儿子最终脱离危险，但仍需在重症监护室监护。

校企合作课题研究培训教师的教科研能力是一种新尝试，碰出了校企合作的感情火花和创新思维。这种以课程教学创新为目标、以研发产品为载体的培训活动增加了校企合作的粘度，也打开了教师教学改革的视野，取得的成果更加刺激了教师的积极性，对于专业带头人致力于专业教学改革提供了新的思路，达到了“授人以欲”到“授人以渔”的目的。其成功的原因主要归纳为24个字：自主研发、入心激欲、过程评价、分层管理、闭环控制。

1.3.1 肺组织显微观察 肺组织切片见支气管纤毛倒伏、脱失，细支气管管壁明显增厚，管腔狭窄，黏液腺增生，大量中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润，上皮细胞变性、坏死，肺泡腔明显扩大，表明COPD模型造模成功。

1.3.2 免疫组化检测 NF-κb蛋白含量按照SABC免疫组化染色试剂盒操作说明进行，组织抗原的检测采用生物素标记的第二抗体与链霉亲和素连接的过氧化物酶及底物色素混合液测定。石蜡切片经酒精脱蜡和水化后，PBS洗涤，枸橼酸缓冲液进行热抗原修复5 min，加入正常山羊封闭液5 min，加入稀释后的NF-κB一抗，4℃过夜，一抗稀释度为1∶100。随后加入生物素化二抗和SABC试剂于30℃孵化50 min，采用DAB显色，苏木素轻度复染，盐酸酒精分化，脱水、透明、封片，以PBS代一抗染色做阴性对照，光镜观察见NF-κB的阳性表达为胞核中出现棕黄色颗粒。HPIAS-1000图文分析系统分析各组数据，计算各组光密度值并进行比较。

2.1 各组大鼠肺及结肠组织中NF-κb蛋白的表达见表1。

主控机主要由主控制器、无线接收模块组成。主控制器主要负责向采集机发送命令，接收数据，并实现监控、分析数据、发出警报等，并可通过串口或USB与PC机配接。

2结 果

1.3.3 NF-κb mRNA 表达的测定 按 Trizol总RNA提取试剂说明书进行操作，提取结肠与肺组织总RNA。合成c-DNA并进行PCR扩增：2×Reaction Buffer10 μl 25 mmol Mg2+4 μl，dTNP1 μl，Radom1 μl，10×Buffer 2 μl，MgCl2 24 μl，10 mmol／L dNTPs 2 μl，上下引物各50ng，Tag DNA多聚酶1U，总体系20μl。具体程序如下：94℃预变性3 min，加Taq聚合酶，进行PCR循环，条件为：94℃变性40 s，退火1 min（NF-κB56℃，β-actin 55℃），56℃退火 30 s，72℃延伸（NF-κB 60 s，β-actin 90 s）1 min，完成 35 个循环后，最后一个循环于72℃再延伸7 min。取PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，运用SensiAnsys凝胶图像分析软件分析条带相对灰度值，β-actin作为内参照标化各组NF-κb mRNA含量。

1.4 统计方法 实验数据用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组均数比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

 

表1 各组大鼠肺及结肠组织中NF-κb蛋白的表达 （x±s）

  

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与便秘模型组比较，②P＜0.01；与 COPD 模型组比较，③P＜0.01

 

组 别 n 肺组织 结肠组织正常对照组 10 0.48±0.10 1.12±0.33 COPD 模型组 10 0.80±0.13① 4.28±1.60①便秘模型组 10 0.96±0.16① 4.93±1.17①COPD 合便秘模型组 10 1.52±0.14 ①②③ 7.81±2.49①②③

表1显示，与正常对照组比较，COPD模型组、便秘模型组、COPD合便秘模型组大鼠肺与结肠组织 NF-κb蛋白表达均明显升高（P＜0.05）；与便秘模型组比较，COPD合便秘模型组大鼠肺与结肠组织中 NF-κb蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与 COPD 模型组比较，COPD合便秘模型组大鼠肺与结肠组织中 NF-κb 蛋白表达显著升高（P＜0.01）。

2.2 各组大鼠肺及结肠组织中NF-κb mRNA的表达 见表2。

 

表2 各组大鼠肺及结肠组织中NF-κb mRNA的表达 （x±s）

  

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与便秘模型组比较，②P＜0.01；与 COPD 模型组比较，③P＜0.01

 

组 别 n 肺组织 结肠组织正常对照组 10 0.13±0.04 0.58±0.22 COPD 模型组 10 0.31±0.03① 1.01±0.06①便秘模型组 10 0.32±0.06① 1.64±0.02①COPD 合便秘模型组 10 0.59±0.05①②③ 2.33±0.49①②③

表2结果显示，与正常对照组比较，COPD模型组、便秘模型组、COPD合便秘模型组大鼠肺与结肠组织中 NF-κb mRNA 表达均明显升高（P＜0.05）；与便秘模型组比较，COPD合便秘模型组大鼠肺与结肠组织中 NF-κb mRNA 表达显著升高（P＜0.01）；与COPD模型组比较，COPD合便秘模型组大鼠肺与结肠组织中 NF-κb mRNA 表达显著升高（P＜0.01）。

3讨 论

有关肺与大肠相表里的理论与临床研究，目前国内外诸多学者已从胚胎组织学、生理学、病理学、经络学、免疫学、微生物学等多角度进行了研究，在一定程度上论证了肺与大肠相关联的可能机制，但有关两者之间的信号通路特别是NF-κb信号通路还存在很大的探索空间。

六是群测群防，加强宣传培训演练。通过制作发放各类宣传材料，在山洪灾害危险区以及转移路线上设立醒目、固定的标示牌和宣传栏，组织开展多层次的培训和演练，使山洪灾害的基本知识和避灾常识深入千家万户，增强基层干部、群众的防灾意识和自救能力。

COPD是肺部疾病的主要体现，慢性气道炎症是COPD发病机制的关键环节之一，研究发现［4］，激活NF-κb已成为肺部炎症性疾病的一个重要特征，作为炎症反应的关键信号转录因子，在炎症细胞因子介导的炎症反应中起着重要作用。本研究表明，与正常对照组比较，COPD组和COPD合便秘模型组的模型大鼠NF-κb蛋白及mRNA表达均有明显升高（P＜0.05）。正如张葵等［5］研究发现，NF-κb 活性伴随大鼠小支气管管壁和平滑肌增厚而增加，说明NF-κb的活化在COPD肺气虚证气道重构中起重要作用。

便秘作为肠道疾病的主要症状，可在溃疡性结肠炎、结肠息肉、克隆恩病等多种肠道疾病出现。当脂多糖、肽聚糖等抗原与肠道APC相结合后，可激活NF-κb信号通路，启动肠道获得性免疫，同时，TNF、IL、INF等炎症因子又反作用于NF-κb信号通路，使NF-κb蛋白转移到细胞核内，调控多种炎症因子相关基因的表达，加重便秘或腹泻等炎症性肠病发生［6］。本实验发现，与正常对照组比较，便秘模型组和COPD合便秘模型组模型大鼠的NF-κb蛋白及其mRNA的表达亦均有明显升高（P＜0.05）。

“肺与大肠相表里”是中医脏腑理论的重要组成部分，肺与大肠并不特指现代医学的肺与大肠，两者之间的联系更多表现在功能相关上，其基础相关性主要表现在胚胎的同源性、黏膜免疫的相关性等方面［7］。研究发现，NF-κb信号通路的激活可以引起哮喘、类风湿性关节炎、牛皮癣、肠炎等许多慢性炎症性疾病炎性蛋白的表达［8］。本实验在“肺与大肠相表里”理论指导下，同时研究了肺与大肠组织的NF-κb信号通路表达，结果显示：与COPD组、便秘模型组比较，COPD合便秘模型组的NF-κb蛋白及其 mRNA 的表达均有显著升高（P＜0.01），意即肺肠同病时肺及结肠组织中NF-κb mRNA及蛋白表达均显著升高，说明“肺与大肠相表里”在NF-κB信号通路机制方面存在内在联系。

参考文献

［1］杨欣，苏慧霞，牛锦龙，等.miR-27a调节 NF-κB2的表达并抑制哮喘小鼠气道炎症反应［J］.免疫学杂志，2016，32（10）：829-834.

［2］宋一平，崔德健，茅培英，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型气道重塑及生长因子的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24（5）：283-287.

［3］谢建超，吴国泰，牛亭惠，等.便秘动物模型的复制概况及评价［J］.实验动物科学，2016，33（5）：64-67.

［4］番库，程兆忠，韩伟忠，等.COPD大鼠模型在不同时期细胞转录因子NF-κB变化及意义［J］.现代生物医学进展，2011，17（11）：3219-3226.

［5］张葵，张樱，陈翌江，等.参芪补肺汤对肺气虚证慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重构中NF-κB和MMP-9，TIMP-1表达的影响［J］.中 国 中 药 杂志，2008，33（18）：2129-2132.

［6］王晓晨，吉爱国.NF-κB 信号通路与炎症反应［J］.生理科学进展，2014，45（1）：68-71.

［7］刘声，杨国旺，王笑民.从胚胎上皮细胞基因表达谱变化分析肺与大肠相表里内涵［J］.中医学报，2016，31（3）：390-393.

［8］赵文昌，宋丽军.NF-κB信号转导通路在治疗炎症性肠炎中的作用［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1792-1794.