胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一种起源于胆管上皮的恶性肿瘤，发病率仅次于肝癌，是原发性肝癌发病率的10%～20%［1-3］。全世界胆管癌发病率最高的地区在东南亚，其中我国胆管癌的发病率普遍高于世界平均水平［4］。近年来，胆管癌发病率呈上升趋势［1，5］。胆管癌发病较隐匿，临床症状不典型，大部分发现时已是晚期，手术治疗切除率低，并缺乏有效的辅助化疗药物。胆管癌的发生发展是多因素、多步骤的病理过程，涉及基因表达的异常［6］，其中胆管癌早期发生转移及术后易复发均为治疗的难题。针对临床胆管癌诊治中的难点进行深入研究，寻找标志性致癌分子，深入探讨胆管癌发生、发展的机制，是提高胆管癌治疗效果和预后的关键所在。细胞自噬（autophagy）是细胞在各种代谢压力下（如能量缺乏、饥饿等）的一种促使细胞内代谢废物降解的生物学行为，是真核细胞进行自我消化从而获得存活机会的一种高度保守生物学过程［7］，是近年来肿瘤致病机制及治疗研究的热点。自噬对于肿瘤来说是一柄双刃剑，既可抑制肿瘤的发生发展，也可以促进肿瘤的发生发展。因此，本研究通过免疫组化检测自噬相关蛋白微管相关蛋白 1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）在胆管癌中的表达情况，探讨LC3蛋白作为胆管癌预后指标的可能性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集广西中医药大学附属瑞康医院病理科2011年1月至2017年12月确诊的75例胆管癌患者标本。所有标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋。同时收集所有研究对象完整的临床资料与随访信息，内容包括年龄、性别、病史、肿瘤大小、肿瘤解剖学类型、病理学分级、第七版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）胆管癌分级、有无淋巴结转移、有无血管侵犯。截至2018年1月完成所有研究对象的随访与调查。手术日期至复发日期或末次随访日期为无复发生存时间。手术日期至死亡日期或末次随访日期为总生存时间。随机选取同期手术切除的20例肝细胞癌的癌旁正常胆管组织作对照分析。

1.2 主要试剂 兔抗人LC3β多克隆抗体为美国NOVUS公司产品；PV9000两步法免疫组化检测试剂盒及浓缩型DAB染色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术公司产品；其他常用试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 免疫组化 切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精至水化；按抗体说明书进行柠檬酸盐高温高压修复；3%H2O2抑制内源性过氧化物酶；滴加适当浓度的Ⅰ抗工作液，4℃冰箱孵育过夜；按试剂盒说明书的两步法滴加Ⅱ抗；滴加DAB显色。对照设计：每批染色分别用Ⅰ抗说明书建议的组织切片做阳性对照；以非免疫正常兔血清代替Ⅰ抗作为阴性对照；空白对照以PBS代替Ⅰ抗。

1.4 结果判定 以胞质棕黄色颗粒为阳性表达。随机选取5个高倍视野（×400），每个视野计数100个肿瘤细胞。按细胞染色强度计分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分（染色深浅需与背景着色相对比）。按阳性细胞所占百分比计分：无阳性细胞或阳性细胞数＜5%为0分，阳性细胞5%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。两项计分相加为最终结果：＞4分为高表达，≤4分为低表达。

单因素分析显示，对于无复发生存时间，年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、血管侵犯、AJCC分期及LC3蛋白表达等因素差异具有显著性意义（P＜0.05或 P＜0.01）。对于总生存时间，年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯、AJCC分期及LC3蛋白表达等因素差异具有显著性意义（P＜0.05 或 P＜0.01），见表 2。胆管癌LC3表达情况对无复发生存时间与总生存时间的影响见图2。

2结 果

2.2 LC3蛋白的表达与胆管癌临床病理特征的关系将LC3蛋白免疫组化染色评分结果与各种临床、病理因素进行卡方检验，分析其相关性。结果表明LC3蛋白的高表达与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及AJCC 分期相关（P＜0.05 或 P＜0.01），与年龄、性别、解剖部位及肿瘤分化程度无关（均P＞0.05），见表1。

  

图1 LC3蛋白的免疫组化表达情况 （×400）

2.1 LC3蛋白的表达情况 LC3蛋白表达定位主要在癌组织与癌旁正常胆管上皮细胞的胞浆内，见图1。在癌组织中LC3蛋白的表达率为57.33%，癌旁正常胆管上皮的表达率为15.00%，两者比较有统计学差异（χ2＝1.330，P＜0.01）。

将上述单因素分析具有显著性差异的指标纳入Cox比例风险模型分别对无复发生存时间和总生存时间进行多因素分析，结果显示：肿瘤大小、血管侵犯及LC3蛋白表达是影响胆管癌患者术后无复发生存及总生存时间的显著性不良预后因素。见表3、表4。

 

表1 LC3的表达与各种临床病理因素相关性分析 （例）

  

因素 n LC3低表达（n＝32） LC3高表达（n＝43） χ2 P年龄 ≤50岁 22 12 10 1.796 0.180＞50岁 53 20 33性别 男 38 16 22 0.010 0.921女37 16 21解剖部位 肝内及肝门部 71 30 41 0.093 0.761肝外 4 2 2肿瘤直径 ＜5 cm 61 31 30 8.880 0.003≥5 cm 14 1 13肿瘤分化程度 低分化/中低分化/中分化 70 28 42 3.052 0.081中高分化/高分化 5 4 1淋巴结转移 有 26 7 19 4.032 0.045无49 25 24血管侵犯 有 29 3 26 20.193 0.000无46 29 17 AJCC 分期 1 期/1A/1B、2 期/2A/2B 41 25 16 12.394 0.000 3期/3A/3B、4期/4A/4B 34 7 27

2.3 LC3蛋白表达与胆管癌患者预后关系分析75例患者中位随访时间为18.32个月，52例患者在随访期间死亡，死亡原因均为肿瘤复发转移、病情进展而导致的多器官衰竭，无其他死亡原因。中位无复发生存时间为 8.75个月，1年复发率为 58.67%，2年复发率为13.33%，3年复发率为1.33%。中位总生存时间为14.83个月，1年、3年、5年总生存率分别为56.00%、33.33%、28.00%。

2018年上半年，中国国内生产总值(GDP)实际同比增长6.8%，延续了稳定增长的态势。在出口较快增长的带动下，制造业投资和民间投资保持着良好的发展势头，消费则继续成为支撑经济增长的主要动力。而在供给一侧，工业增加值同比增速也稳定在6.6%—6.9%之间，与实际GDP增速的走势基本一致。中国经济表现出相当的韧性。

1.5 统计学方法 所有数据均通过SPSS17.0软件包分析，计数资料的描述采用率或构成比，计数资料采用卡方检验或Fisher’s精确检验。采用Kaplan-Meier法绘制无复发生存曲线及总生存曲线，Logrank法对组间生存率进行比较。初步筛选无复发生存率和总体生存率的影响因素。将各临床病理因素纳入Cox比例风险模型进行多因素分析，确定预后影响因素。P＜0.05为有统计学差异。

 

表2 75例胆管癌患者切除术后无复发生存时间（RFS）及总生存时间（OS）单因素分析

  

注：① P＜0.05，② P＜0.01

 

因素中位RFS（月） 中位OS（月）年龄 ≤50岁 22 9.53① 29.52①＞50 岁 53 8.17 14.70 n性别 男 38 9.63 21.80女37 8.17 15.13解剖部位 肝内及肝门部 71 8.93 14.87肝外 4 6.60 10.37肿瘤直径 ＜5 cm 61 11.87② 16.77②≥5 cm 14 3.33 6.50肿瘤分化程度 低分化/中低分化/中分化 70 8.48① 14.67中高分化/高分化 5 42.72 52.57淋巴结转移 有 26 4.23 7.03①无49 9.50 16.77血管侵犯 有 29 4.97② 9.60①无46 9.63 16.77 AJCC分期 1期/1A/1B、2期/2A/2B 41 9.53① 16.77①3 期/3A/3B、4 期/4A/4B 34 8.57 9.93 LC3蛋白表达 低表达 32 42.54② 59.43②高表达 43 4.07 6.80

  

图2 胆管癌LC3表达情况对无复发生存时间与总生存时间的影响

试题充分强调了“英语学科核心素养”的渗透和考查：在语言能力方面，强调考查考生在真实情境中对语言知识的掌握和运用；在文化品格方面，强调对中外文化的理解和认同，注重考生跨文化意识和民族文化常识的考查。要求考生既要有国际视野，又要有家国情怀；既要会跨文化交流，也要重文化传承；既要了解西方文化礼仪，尊重文化差异，又要有民族文化自信；在思维品质方面，强调把对思维的考查融入语言知识和语言技能的考查中，着重考查考生的思维逻辑性、思辨性和创造能力和水平；在学习能力方面，是对运用英语学习策略效果的综合考查。

 

表3 75例胆管癌患者切除术后无复发生存时间多因素分析

  

因素 B SE Wald RR95%CIP肿瘤大小 1.190 0.322 13.645 3.2871.748～6.1800.000血管侵犯 0.735 0.272 7.321 2.0861.225～3.5520.007 LC3 蛋白表达 2.329 0.417 31.245 10.2714.538～23.2450.000

 

表4 75例胆管癌患者切除术后总生存时间多因素分析

  

因素 B SE Wald RR肿瘤大小 1.012 0.336 9.063 2.750血管侵犯 0.706 0.282 6.269 2.026 LC3 蛋白表达 2.505 0.434 33.375 12.248 95%CI 1.423～5.313 1.166～3.521 5.235～28.657 P 0.003 0.012 0.000

3讨论

自大隅良典教授从酵母中鉴定得到多个与自噬相关的蛋白（autophagy associated gene，ATG）以来，近20年来自噬领域的研究快速发展，大隅良典也因此获得了2016年的诺贝尔生理和医学奖［8-9］。自噬是一种进化上高度保守的细胞死亡方式，在哺乳动物中，其主要过程是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。研究表明许多肿瘤可检测到自噬相关基因的缺失［10］，导致抗凋亡蛋白的表达大量增加，从而促进肿瘤的发生［11］。自噬活性的缺失还会导致DNA损伤，增加基因组的不稳定性，诱导细胞突变［12］。此外，多种抑癌基因如 PTEN、P53、ERM 结合蛋白 50（ERMbinding protein 50，EBP50）等也可以通过调控自噬活性抑制肿瘤的增殖与转移［13］。这些都证实了自噬的存在是机体抑制肿瘤生长，维持内环境稳态的重要机制。而另一方面，自噬也可以帮助肿瘤细胞对抗不良的生长环境，维持肿瘤细胞产物合成及代谢的平衡，从而促进肿瘤的发生发展，抑制自噬活性可以导致肿瘤体积缩小［14］。

全面预算管理要以公司组织结构为基础，合理确定预算控制主体。遵循“谁使用、谁承担、谁管理、谁控制”的原则，充分发挥归口管理部门在预算控制中的作用。同时制定一套科学完善、严谨规范的组织制度为全面预算管理的有效实施提供保障。在制度建立的过程中，要对相关部门的权责进行明确，同时阐明预算目标，并对预算编制、审批、执行、考核等一系列程序进行合理的制定。在制度构建完成后，要将制度的落实和企业文化建设有机的结合起来，使其逐渐成为一种文化，渗透到广大员工的行为习惯中。

LC3主要定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成，是诊断自噬活动的金标准之一。Sasaki等［15］通过研究发现，对比非肿瘤性大胆管上皮细胞，胆管上皮内瘤变、胆管内乳头状瘤及胆管浸润性癌细胞的LC3、Beclin 1及P62的表达均有显著增高，与本研究结果一致，提示自噬参与胆管癌肿瘤的形成与发展。同时，本研究结果还显示，LC3蛋白的高表达在不同肿瘤大小、不同AJCC分期、有无淋巴结转移及血管侵犯患者间存在显著差异，提示自噬可能在促进肿瘤细胞发展和转移，促进癌细胞浸润和迁移方面起重要作用。

通过对学生的合作能力进行培养，有助于学生掌握更多的社会与学习技能，促使学生学会对问题进行探究的方法，使得彼此之间的信任感得以强化。同时，学生也能够敢于将自己的观点表达出来，充分认识到开展合作学习的重要价值。如果在学习方面出现一定的分歧，同学之间会采用更加友好的态度去解决存在的问题。在此过程中，教师要充分发挥其在合作学习中的引导作用，促使学生能够充分感受到学习所带来的快乐，进而提升其学习能力，使得学生的语文素养不断得到提升，同时学生之间的关系也会更加友好。

对于自噬与胆管癌预后的关系，则有学者持不同意见，Dong等［16］认为虽然大部分胆管癌患者组织中Beclin 1 mRNA及蛋白均高表达，但不良预后及淋巴结转移却与Beclin 1蛋白弱表达关系更密切。Nitta等［17］则主张自噬不仅与胆管癌的恶性表型及不良预后相关，而且通过作用肿瘤间质转化而增强肿瘤细胞的侵袭性。不少研究支持营养缺乏能诱导胆管癌细胞激活自噬，自噬能诱导胆管癌细胞对化疗不敏感，应用某些药物、天然合成物或自噬抑制剂抑制自噬，能提高肿瘤细胞在缺营养情况下的死亡率以及对化疗的敏感性［18-25］，甚至能通过下调自噬抑制胆管癌肿瘤细胞的侵袭能力［18］。本研究分析LC3表达与胆管癌患者复发和生存的关系及其对预后的影响，结合随访资料发现，LC3高表达患者无复发生存时间及总生存时间均远短于LC3低表达的患者，Cox多因素风险模型分析亦证实，肿瘤大小、血管侵犯及LC3蛋白表达是影响胆管癌患者术后无复发生存及总生存时间的显著性不良预后因素，提示自噬与胆管癌的预后相关，LC3可以作为判断胆管癌临床预后的生物学指标。

综上所述，LC3在胆管癌中表达升高，提示自噬可能与胆管癌的发生、发展及不良预后相关。在未来的研究中，本课题组将深入探讨自噬影响胆管癌发生发展以及胆管癌中自噬调控的具体机制，以期为胆管癌的肿瘤临床治疗领域提供新的基因靶点。

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