胃癌是临床上常见的恶性肿瘤，侵袭性较强，60%以上患者表现为远处转移[1]。进展期胃癌预后较差，其5年生存率低于40%[2-3]。胃癌一旦发生转移，其恶性程度更高，患者生存预后更差。既往研究[4]认为糖酵解途径是恶性肿瘤获得营养和能量的主要方式，然而近年来有学者发现[5]约有45%胰腺癌患者PET-CT为阴性，提示恶性肿瘤代谢方式呈多样性，除糖酵解外，可能存在其他代谢方式。Cassago等[6]报道称阻断胃肠胰神经内分泌肿瘤的谷氨酰胺代谢途径，肿瘤细胞增殖会受到明显抑制，说明谷氨酰胺代谢方式也是恶性肿瘤能量获取来源之一。谷氨酰胺酶1型（glutaminase1，GLS1）是谷氨酰胺分解代谢的关键酶，其参与谷氨酰胺代谢主要是通过PI3K-AKT-mTOR信号通路实现的。鉴于此，本研究对胃癌组织GLS1及PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白Raptor、Rictor表达水平进行检测，并进一步分析GLS1表达与临床预后的关系，旨在为胃癌预后评价提供新的参考指标。

资料与方法

1 一般资料 经医院伦理委员会批准，选择2009年5月～2012年5月医院行手术治疗的88例胃癌患者作为研究对象，男性54例，女性34例，年龄32～68岁，平均（57.2±4.5）岁。病理类型：腺癌75例，非腺癌13例；按照胃癌Lauren分型标准：弥漫型20例、肠型68例；病理分级：低分化45例，中分化26例，高分化17例；按照美国癌症联合委员会[7]（American Joint Committee on Cancer，AJCC）胃癌TNM分期标准：Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例，Ⅳ期组24例。

班会课的铃声响了，我拿着一张白纸走进教室。学生投来关注的目光：老师要干什么？看到大家如此好奇，我卖了个关子：“今天我们来做一个小测试。”

通过血清学检测发现，在51280份标本中，51043份标本为HBsAg阴性，25份标本为单试剂阳性，212份标本为双试剂阳性。

2 纳入与排除标准 纳入标准：①所有患者术前均经病理学证实；②胃癌首发病例，入组前未接受任何抗癌治疗；③患者行胃癌根治术或姑息性切除术；④研究及治疗方案取得患者和家属同意，并签署知情同意书。排除标准：①合并有其他恶性肿瘤；②既往接受过化疗、放疗和其他抗癌治疗者；③患者病历资料不完整。

3.3 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测组织GLS1、Raptor、Rictor mRNA表达：按照TRIzol RNA试剂盒说明书提取胃癌组织、癌旁组织总RNA，紫外分光光度法进行定量。取1μg总RNA按照cDNA合成体系逆转录成cDNA；cDNA合成体系：焦磷酸二乙酯（DEPC）2 μl，反转录缓冲液5 μl，RNA逆转录模板0.5 μl，dNTP0.11 μl，逆转录酶1.5 μl，上下游引物各1μl，加入双蒸水将总反应体系补充至25μl，37℃金属浴反应50 min合成cDNA。将cDNA置于PCR反应体系中扩增，引物序列：GLS1上游：5＇-GGGTCAAAGATCACGTGCACAG-3＇，下游：5＇-TTGTCAAAGCAGACGGAGGTC-3＇；Raptor上游：5＇-GCTGGTGTTATGTGAAGTTTTCAAG-3＇，下游：5＇-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAA-3＇；Rictor上游：5＇-GAAGATGGTGATGGGATTT-3＇，下游：5＇-CAAGCTTCCCG T T C T C A G C C-3＇；G A P D H 上游：5＇-GGTGAACGTGCGTCTCAAGC-3＇，下游：5＇-GTCGGTGGTGGAAGATCGTC-3＇。PCR反应体系：DNA提取物1 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，Taq酶1 μl，延伸体系2 μl，ddH2O 15 μl，上下游引物各0.5 μl，总反应体系23 μl。反应条件：96℃预变性1 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；72℃ 5 min；以GAPDH为内参照进行校正，检测目的基因CT值（2-△△CT）。

3.1 样本采集：所有患者均于手术时切取胃癌组织，同时配对切取距癌组织切缘≥10 cm的非肿瘤胃黏膜上皮组织（癌旁组织），上述组织均于低温时采集，切除后立即置于液氮中，-80℃保存。

4 随访 对患者进行3～5年随访，随访通过电话或门诊复查进行，随访从术后第2天开始，截止日期为随访结束或患者死亡或失访之日，生存时间以术后第2天开始计算。

3 方法

3.2 免疫组织化学检测组织GLS1、Raptor、Rictor蛋白表达：取胃癌组织和癌旁组织样本，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，制成4 μm连续切片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，PBS洗脱3次，5 min/次。室温下加入3 ml/L H2O2甲醇液孵育30 min消除内源性过氧化酶，再向切片中加入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，微波抗原修复。PBS洗脱3次，滴加3%山羊血清封闭液体，37℃孵育10 min弃去封闭液。分别加入1∶500稀释的兔抗人GLS1多克隆抗体、1∶2 000稀释的兔抗人Raptor多克隆抗体和1∶500稀释的兔抗人Rictor多克隆抗体，湿盒中4℃孵育24 h。PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次。DAB显色液显色，苏木素复染、脱水，中性树胶封片。阴性对照组为PBS替代一抗。评分标准：根据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞＜10%代表0分，阳性细胞10%～25%代表1分，阳性细胞26%～50%代表2分，阳性细胞51%～75%代表3分，阳性细胞＞75%代表4分；根据染色强度评分：无染色0分，轻度染色1分，中度染色2分，重度染色3分。以染色强度×阳性细胞所占百分比为总分，总分≤3分代表阴性，＞3分代表阳性。

既往研究认为糖酵解是恶性肿瘤快速生长获取能量和营养的主要代谢方式，PET-CT检查正是基于高糖酵解这一特点而实现的。然而临床上发现并非所有恶性肿瘤PET-CT均为阳性，提示糖酵解可能并非是恶性肿瘤唯一的代谢途径。贺文兴等[8]报道乳腺癌主要以谷氨酰胺作为主要氮源，为肿瘤细胞的增殖、分化提供能量。谷氨酰胺作为人体内含量最丰富的氨基酸，能够通过去氨基作用为三羧酸循环提供回补能量，在肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用。GLS1是调节谷氨酰胺代谢的关键酶，陈昆仑等[9]报道宫颈癌细胞株谷氨酰胺代谢旺盛，细胞株GLS1表达水平显著高于正常细胞，提示GLS1可能作为调节谷氨酰胺代谢的蛋白，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥作用。然而目前对GLS1的作用机制依然不完全清楚，有学者发现[10]GLS1需要依赖PI3K-AKT-mTOR信号途径实现对谷氨酰胺代谢的调节作用。

结 果

4 胃癌组织GLS1表达与患者生存率的关系 本研究随访至2016年5月30日，随访31～52个月，中位随访时间38.7个月。88例患者随访83例，失访5例；生存曲线分析显示，GLS1阴性患者3年累积生存率为78.1%（95%CI：28.316%～65.684%），高于GLS1阳性患者3年累积生存率为47.2%（95%CI：21.159%～48.841%），有统计学意义（P＜0.05），见图3。

3 胃癌组织GLS1表达与临床病理特征的关系 胃癌组织GLS1表达与性别、年龄、病理分型、组织分型无关（P＞0.05），肿瘤直径＞5 cm、低分化肿瘤、Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴结转移、浸润深度为T3～T4者GLS1阳性率显著升高（P＜0.05），见表2。

2 胃癌组织和癌旁组织GLS1、Raptor、Rictor mRNA表达比较 胃癌组织GLS1、Raptor、Rictor mRNA表达相对表达量分别为1.04±0.21、1.73±0.32、1.32±0.17，均显著高于癌旁组织0.65±0.09、0.81±0.12、0.75±0.11，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

在政策基础上，实行国家机关“谁执法谁普法”责任制的政策依据主要是中共十八届四中全会的决议以及“六五”、“七五”普法工作规划。

 

表1 胃癌组织和癌旁组织GLS1、Raptor、Rictor蛋白表达比较 （n，%）

  

组别 例数GLS1RaptorRictor阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性胃癌组织8871（80.7）17（19.3）65（73.9）23（26.1）78（88.6）10（11.4）癌旁组织8834（38.6）54（61.4）21（23.9）67（76.1）41（46.6）47（53.4）χ2值 32.320 44.023 35.522 P值 ＜0.001＜0.001＜0.001

  

图1 GLS1、Raptor、Rictor蛋白在胃癌组织阳性表达（ICH，×200）

  

图2 胃癌组织与癌旁组织GLS1、Raptor、Rictor mRNA表达

1 胃癌组织和癌旁组织GLS1、Raptor、Rictor蛋白表达比较 GLS1、Raptor、Rictor蛋白均表达于细胞质和细胞核，胃癌组织GLS1、Raptor、Rictor蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织（P＜0.05），见表1、图1。

 

表2 胃癌组织GLS1表达与临床病理特征的关系[n（%）]

  

病理特征 例数（n） 阳性（n=71） 阴性（n=17） χ2值P值性别 男5446（85.2）8（14.8）1.8190.177女3425（73.5）9（26.5）年龄（岁） ＞604940（81.6）9（18.4）0.0640.800≤603931（79.5）8（20.5）肿瘤直径（cm） ＞53328（84.8）5（15.2）0.5880.443≤55543（78.2）12（21.8）病理类型 腺癌7562（82.7）13（17.3）1.2830.257非腺癌13 9（69.2）4（30.8）组织分型 肠型6855（80.9）13（19.1）0.0080.930弥漫型2016（80.0）4（20.0）分化程度 中、高分化4330（69.8）13（30.2）6.4270.011低分化4541（91.1）4（8.9）TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期3119（61.3）12（38.7）11.5460.001Ⅲ～Ⅳ期5752（91.2）5（8.8）淋巴结转移 是5350（94.3）3（5.7）15.948 ＜0.001否3521（60.0）14（40.0）浸润深度T1～T23723（62.2）14（37.8）14.049 ＜0.001 T3～T45148（94.1）3（5.9）

5 GLS1表达对胃癌患者预后的影响 Cox单因素回归分析显示，GLS1表达、肿瘤直径、分化程度、TNM分期是影响胃癌患者预后的因素（P＜0.05）；Cox多因素回归显示，GLS1表达、分化程度、TNM分期是影响胃癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表3～4。

讨 论

5 统计学处理 应用SPSS19.0软件包对数据进行处理，计数资料以百分率（%）的形式表示，采用χ2检验或fishers确切概率法分析GLS1与临床病理特点的关系；患者生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-Rank test比较组间生存率的差异，采用Cox回归模型分析影响胃癌患者预后的因素，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.3 观察指标 观察并记录两组患者临床疗效，术前术后宫腔长度、月经改善、宫腔粘连等变化情况，分析比较。

  

图3 GLS1阳性、阴性表达胃癌患者生存曲线

PI3K-AKT-mTOR是一条经典的信号通路，主要介导一系列底物磷酸化，发挥促进肿瘤细胞增殖、分化、耐药及抗凋亡作用[11]。国外研究证实[12]mTOR能够与Raptor、Rictor两种受体结合，并形成mTORC1和TORC2复合物，从而启动磷酸化AKT氨基酸残基，使谷氨酰胺代谢增强，为肿瘤细胞生长提供充足的能量和物质供应。目前对肿瘤细胞中mTOR、GLS1介导的谷氨酰胺代谢机制研究较少，在胃癌更是鲜见报道。本研究显示，胃癌组织GLS1、Raptor、Rictor蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织，胃癌组织GLS1、Raptor、Rictor mRNA表达亦显著高于癌旁组织，提示胃癌可能也存在相同的能量获取路径：即胃癌细胞也依赖谷氨酰胺代谢方式获取能量，而GLS1参与调节谷氨酰胺代谢依赖于PI3K-AKT-mTOR信号通路。这一研究结果也提示，通过检测GLS1水平能够为诊断及预测胃癌预后提供依据。

 

表3 Cox单因素回归分析影响胃癌预后的因素

  

HR95%CIP值GLS1表达 阳性 vs 阴性3.7031.779～8.039＜0.001肿瘤直径 ＞5cm vs ≤5cm2.4911.335～5.037 0.004分化程度 低分化vs 中、高分化2.7311.581～4.918＜0.001 TNM分期 Ⅲ～Ⅳ期 vs Ⅰ～Ⅱ期3.0911.273～8.391 0.001项目

 

表4 Cox多因素回归分析影响胃癌预后的因素

  

HR95%CIP值GLS1表达 阳性 vs 阴性3.7731.791～8.2910.001分化程度 低分化vs 中、高分化2.2651.185～4.4190.013 TNM分期 Ⅲ～Ⅳ期 vs Ⅰ～Ⅱ期2.2791.299～4.0010.005项目

GLS1高表达能够诱导谷氨酰胺代谢旺盛，促进肿瘤细胞生长；抑制GLS1表达能够抑制细胞生长。Matés等[13]报道称GLS1通过影响线粒体摄取，提高谷氨酰胺的利用率。Qie等[14]采用GLS1抑制剂BPTES干扰乳腺癌细胞株GLS1的表达，结果显示干扰48 h后细胞生长明显受到抑制。本研究显示，肿瘤直径＞5 cm、低分化肿瘤、Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴结转移、浸润深度为T3～T4的胃癌患者GLS1阳性率显著升高，说明GLS1可能参与了胃癌的生长、浸润转移。随着肿瘤体积的增大，其对能量代谢的需求更高，此时细胞会上调GLS1表达，使得谷氨酰胺代谢增强，以满足肿瘤细胞对能量的需求。陈港心等[15]报道肿瘤体积、分化程度、TMN分期、淋巴结转移是胃癌不良预后的独立危险因素，结合本研究结果，提示GLS1高表达可能反映胃癌的不良预后。为了证实上述结论，本研究对胃癌患者进行随访，结果显示GLS1阴性组3年累积生存率显著高于阳性组。Thomas等[16]采用GLS1抑制剂处理胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株，结果显示GLS1蛋白表达下调，肿瘤细胞增殖和克隆生长能力明显降低。Xiang等[17]也证实抑制GLS1能够使谷氨酰胺代谢受阻，细胞生长周期阻滞，凋亡增加。多因素回归分析也证实，GLS1高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素。这亦提示，GLS1能够作为胃癌治疗的潜在作用靶点，为胃癌治疗提供新的方向。

综上所述，GLS1在胃癌组织表达显著升高，GLS1表达越高，患者预后越差，GLS1可以作为胃癌临床预后评估的指标之一。

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参 考 文 献

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