胆红素（Bilirubin）是血液循环中衰老红细胞在肝、脾及骨髓的单核-巨噬细胞系统中分解和破坏的产物，检测胆红素的代谢情况作为肝胆疾病等诊断的重要指标已广泛应用于临床[1-3]。目前测定血清总胆红素（TBIL）的方法包括重氮试剂法（如改良J-G法和M-E法等）、胆红素氧化酶法和化学氧化法（如钒酸氧化法）等。M蛋白（即单克隆免疫球蛋白，monoclonal immunoglobulin，亦称副蛋白，paraprotein）是单株B淋巴细胞或浆细胞异常增生而分泌的一种在组成和顺序上十分均一的免疫球蛋白分子或其片段，多见于多发性骨髓瘤（multiple myeloma MM）、原发性巨球蛋白血症（WM）、恶性淋巴瘤等B淋巴细胞或浆细胞克隆增殖性疾病[4]。有文献报道M蛋白对高密度脂蛋白[5]、肌酐[6]、尿素氮[7]、磷酸[8]、钙[9]、铁[10]、C-反应蛋白[11]等生化指标的测定存在干扰。近年来亦有报道M蛋白对胆红素测定存在干扰[12]，但各种方法学的干扰情况未见报道，这些干扰可能导致误诊、治疗不当、延误病情等。本研究通过对247例M蛋白阳性患者血清采用干化学法、重氮法、钒酸氧化法测定总胆红素，并对胆红素结果分组进行分析，以初步探讨M蛋白对重氮法与钒酸氧化法测定胆红素的影响，现报道如下。

材料与方法

1 标本来源 对2015年8月～2017年6月在安徽医科大学附属安庆医院经琼脂糖凝胶电泳技术检测M蛋白阳性的门诊及住院患者血清作为实验组，这些标本无溶血、脂血，且没有重复标本，若是同一患者即为患者不同时期血清。根据临床资料将实验组分为多发性骨髓瘤（MM）组和M蛋白阳性的非MM组，MM组均满足多发性骨髓瘤诊断标准[13]。按照与实验组性别构成和年龄频数随机取样，选取本院门诊及住院血清蛋白电泳M带阴性患者的无溶血、脂血血清为对照组。

其中：Δe13为微分算子，由微分旋转矩阵减去单位阵得来；δθ13x、δθ13y、δθ13z分别表示定位器1的z方向主动移动副与理想x，y，z轴的角度误差。δP表示托架中心点相对于基坐标系的位置误差，δP=(δxp,δyp,δzp)T；δl13表示定位器1的z方向位置度误差，δl21、δl23、δl33、δl43定义类似；表示定位器i对应的球铰中心相对于托架坐标系原点的位置误差，表示托架坐标系相对于基坐标系旋转矩阵的微分,

2 标本收集 抽取入选实验组患者清晨空腹静脉血5 ml，3 500 r/min离心10 min后，吸取上清液保存于-72℃冰箱。收集实验前2 d入选对照组血清，保存于-72℃冰箱。

3 试剂与仪器 法国西比亚HYDRASYS2琼脂糖凝胶电泳仪，型号SEBIA-HYA；EPSON PERFECTION V700 PHOTO扫描仪，SEBIA HYDRAGEL PROTEIN（E） 54试剂盒；Roche MODULAR 自动化分析仪;强生VITROS 5.1FS干式生化仪；重氮法总胆红素试剂盒由ROCHE提供，钒酸氧化法总胆红素试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供；总胆红素干片试剂盒由VITROS 提供；Panasonic医用低温箱，型号MDF-U3386S。

4.2 抗M蛋白干扰的验证：应用VITROS 5.1FS干式生化仪采用干化学法，Vitros 950被证实具有抗M蛋白干扰的能力[5，12，14，15]，VITROS 5.1FS干化学与 Vitros 950检测原理相同，使用相似类型的干片试剂，采用多涂层薄膜干片技术，共5层，样本到达试剂层前必须先穿过扩散层，扩散层能均匀分布样本，同时过滤大分子，阻挡干扰物质[16]。所有操作严格按照SOP文件严格执行。

1.1.2 5771R 2002年春以埃塞俄比亚芥细胞质的甘蓝型油菜品系572R为母本，与甘蓝型油菜双低品种湘油13Y(从湖南省大面积油菜生产区引进的湘油13中的1个选系)进行杂交，采用常规杂交育种程序经过8代的连续定向选择，于2007年育成埃塞俄比亚芥细胞质的甘蓝型油菜双低优质常规品系(隐性核不育的恢复系)5771R，其为贵州省农业科学院油菜研究所自育材料。

4 检测方法

5 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计分析，经Kolmogorov-Smirnov Tes检验正态性，仅对照组各指标满足正态性分布，对照组组内比较时采用配对样本t检验，其余指标间的比较采用非参数Kruskal-Wallis H检验，对有统计学差异的指标进行两两比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

嫁接完成后立即灌一次水，提高砧木的根压，强化向接穗输送水分的能力，防止接穗脱水、干枯，影响嫁接成活率。以后每15 d左右灌一次水，7月上旬结合灌水施尿素112.5 kg/hm2,补充氮肥。到8月份后要控制灌水，防止新稍徒长、枝条木质化程度低。

1 一般情况 247例M蛋白阳性患者中，MM组70例，其中男43例，女27例，年龄39～79岁，中位年龄64岁；非MM组177例，其中男113例，女64例，年龄36～89岁，中位年龄67岁；M蛋白阴性患者50例为对照组，男32例，女18例，年龄41～84岁，中位年龄66岁。

对MM组、非MM组和对照组的组内gzd和gfd分析，仅对照组的差异无统计学意义（P＞0.05），MM组与非MM组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。MM组gzd与对照组gzd比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；非MM组与对照组gzd比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；MM组与非MM组gzd比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。MM组与对照组gfd比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；非MM组与对照组gfd比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；MM组与非MM组gfd比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

 

表1 MM组、非MM组和对照组总胆红素检测结果

  

注：a**P＜0.001,#P=0.111

 

例数 干化学法 重氮法 钒酸氧化法gzdgfdgzd-gfd MM组7010.35(7.98,13.45)(1.50,4.10)-3.85(-6.50,-1.25)**非MM组17712.00(9.05,15.85)10.55（7.98,16.83）(4.68,10.73)-0.85(-3.83,1.80)7.052.85 10.70(7.10,14.80)9.00(6.20,12.45)1.70(-0.40,3.00)(1.60,4.30)-1.10(-3.48,0.10)**3.00(0.48,1.93)-0.15(-0.68,0.33)#对照组5013.85(9.70,20.10)12.75(8.93,19.05)12.70(8.48,19.33)1.05(0.40,1.80)1.30

 

表2 MM组、非MM组和对照组组间gzd、gfd比较

  

gzdgfd Chi-Square29.38595.905 df 2 2 P值 ＜0.001＜0.001

 

表3 MM组、非MM组和对照组组间gzd、gfd比较

  

比较组别P值gzdgfd MM组-对照组 ＜0.001＜0.001非MM组-对照组 0.014＜0.001 MM组-非MM组 ＜0.001 0.435

2 数据分析 对各组的干化学法胆红素值与重氮法、钒酸氧化法胆红素的差值进行统计分析。干化学法与重氮法胆红素的检测结果差值记为gzd，干化学与钒酸氧化法胆红素的检测结果差值记为gfd。应用SPSS16.0软件进行统计分析，经Kolmogorov-Smirnov Tes检验正态性，所有指标仅对照组指标满足正态分布，采用[M（P25，P75）]描述。对照组、MM组与非MM组的组内比较采用配对资料的非参数Kruskal-Wallis H检验，见表1。对MM组、非MM组、对照组的组间gzd和gfd进行3样本完全随机资料的非参数Kruskal-Wallis H检验，见表2，对差异有统计学意义的指标进行两两比较，见表3。

4.1 胆红素的测定：从-72℃冰箱中取出上述3组血清，缓慢平衡至室温。在MODULAR自动化分析仪上分别采用重氮盐法、钒酸氧化法测定每份标本的胆红素浓度。

讨 论

有文献报道[5，12，17]，M蛋白对胆红素测定存在干扰。为探讨M蛋白在重氮法与钒酸氧化法检测胆红素中的影响，本研究对247例M蛋白分别用重氮法、钒酸氧化法、干化学法检测其胆红素，并对各组中干化学胆红素值与重氮法、钒酸氧化法胆红素的差值进行分析。从对照组的组内gzd、gfd分析发现，钒酸氧化法测胆红素略低于重氮法，但其差异无统计学意义，可认为在M蛋白阴性患者血清中，重氮法与钒酸氧化法测胆红素的差异无统计学意义。对MM组与非MM组组内分析，可见两组组内重氮法与钒酸氧化法检测总胆红素的差异均有统计学意义，可能是不同患者M蛋白量的不同使重氮法与钒酸氧化法的胆红素检测结果差异较大。对MM组、非MM组、对照组的组间gzd、gfd进行分析，发现MM组、非MM组与对照组的重氮法与干化学法总胆红素检测结果的差值比较差异均有统计学意义（P＜0.05），说明M蛋白影响了重氮法总胆红素的检测结果；非MM组与对照组重氮法与干化学法总胆红素检测结果的差值比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明非MM患者M蛋白影响了重氮法总胆红素的检测结果；MM组与非MM组的重氮法与干化学法总胆红素检测结果的差值比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明MM患者和非MM患者的M蛋白对重氮法总胆红素检测结果的影响不同，可能与MM患者和非MM患者的M蛋白含量差异较大有关，MM患者一般M蛋白含量大，而非MM患者一般M蛋白含量小。MM组与对照组的钒酸氧化法与干化学法总胆红素检测结果的差值比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明MM患者M蛋白影响了钒酸氧化法总胆红素的检测结果；非MM组与对照组钒酸氧化法与干化学法总胆红素检测结果的差值比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明非MM患者M蛋白影响了钒酸氧化法总胆红素的检测结果；MM组与非MM组钒酸氧化法与干化学法总胆红素的检测结果差值比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明MM与非MM患者的M蛋白对钒酸氧化法总胆红素检测结果的影响无差异，可能与M蛋白和钒酸氧化法的反应环境相互作用有关。

重氮法测胆红素系采用2点终点实验，该方法是在1个比色皿中进行的，随着R2的加入，将实验条件改变为酸性更强（pH值1～2）的环境，而M蛋白在该环境下可能会与R2形成不溶性复合物，从而引起干扰。M蛋白对重氮法胆红素测定似乎具有浓度依赖性[15]。M蛋白增高是骨髓增殖性疾病的重要标志，而正常人血清中检测到M蛋白的发生率随年龄的升高而增加[17]。MM组为确诊多发性骨髓瘤患者的血清样本，非MM组为良性增殖性病变或非血液系统增殖性病变的老年人，其免疫球蛋白与MM组相比浓度较低，从而非MM组中M蛋白与R2形成的不溶性复合物引起的干扰亦较小，使重氮法胆红素测定在MM组与非MM组中产生的干扰程度不同。钒酸氧化法检测胆红素是在pH3.0左右的缓冲液中，在起加速剂作用的表面活性剂的作用下，样本中的总胆红素被钒酸盐氧化成胆绿素，在450 nm处胆红素的黄色特异性吸光度的下降与样品中的胆红素含量成正比。有文献报道，反应液在读数时间内出现乳状混浊，且混浊随着时间延长颗粒变粗[18]。反应液pH、离子强度、温度或溶剂性质等条件的改变均可导致蛋白质性质发生改变，使其溶解度下降而形成沉淀。当表面活性剂难以溶解M蛋白在酸性环境下产生的沉淀时，即出现干扰，故M蛋白存在时钒酸氧化法胆红素测定均存在干扰。

当室内环境湿度高于设定湿度时，压缩机运行，并开启除湿电磁阀除湿；当室内环境湿度达到设定湿度时，除湿电磁阀关闭。当室内环境湿度高于设定湿度，且室内环境温度低于设定温度时，压缩机持续运行对环境进行制冷除湿，同时电加热分级投入，保证环境温度不会降至太低。

本研究中发现在MM组中有1例非黄疸患者，重氮法检测胆红素结果为中高度增高，与临床体征严重不符，而其钒酸氧化法与干化学法总胆红素检测结果均正常，与临床体征相符，说明少数MM患者M蛋白对重氮法总胆红素测定的干扰严重，可能存在其他干扰因素，有待下一步深入研究。在非MM组中，1例非黄疸样本钒酸氧化法出现负值，而重氮法检测出现亚临床黄疸。该病例为小B细胞淋巴瘤患者，由于克隆性Ig自身独特的物理、化学及免疫学特性，可能与钒酸盐试剂反应，或与分析体系中的组分发生特异或非特异性结合出现不可能的负值。本研究未全面检测各组患者的免疫球蛋白的浓度及M蛋白的分型，缺少干扰产生的频率及大小与浓度及类型的关系。后续将完善浓度及分型检测结果，以进一步深入研究。

参 考 文 献

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