竹节参系五加科植物竹节参(Panax japonicus.C.A.Mey)的干燥竹鞭状根茎，又名竹节人参、竹节三七、白三七等，是湖北省特色药用植物资源之一，是我国西南地区土家族、苗族集聚地民间常用中草药，收载于《中国药典》(2005年版一部)，现代药理研究表明，竹节参具有抗炎、抗氧化、免疫调节、保护心肌缺血、抗衰老等多种药理作用[1-4]。由于其兼具北药人参滋补强壮和南药三七活血化瘀之功效，近年来特别是在神经系统方面受到了广泛关注。研究[5-7]表明，竹节参皂苷可增强人神经母细胞瘤来源的SK-N-SH神经细胞株的轴突及树突生长，从而活化神经元形成新的突触连接，可改善Aβ诱导的记忆障碍和突触连接损伤，对D-半乳糖致衰老大鼠认知功能障碍有明显的改善作用，且其具有良好的抗氧化作用。但竹节参皂苷对D-半乳糖致SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用鲜有报道。基于此，本文采用体外培养SH-SY5Y神经细胞，给予D-半乳糖刺激建立损伤模型，探讨竹节参皂苷对SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用与机制，从而为临床治疗神经退行性疾病提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 细胞株 SH-SY5Y神经细胞由华中科技大学惠赠。

1.2 药物与试剂 竹节参购于湖北省恩施竹节参种植基地，经三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物。竹节参皂苷取自竹节参干燥根茎粗粉，加入 60%乙醇加热回流3次，合并滤液后浓缩干燥，得到竹节参总提物粉末，得到率为 25.8%[8]。D-半乳糖(美国Sigma公司)；高糖 DMEM ( 美国GIBCO 公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)； 胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Sirt1抗体(美国Millipore公司)；β-actin(武汉谷歌生物科技有限公司)。

1.3 仪器 NU-4750E 型CO2培养箱购于美国NuAire公司，JA2003 电子分析天平购于上海天平仪器厂，DMR型多功能显微镜及图像分析系统购于英国Syngne公司，SW-4T-2F洁净工作台购于上海江莱生物科技有限公司，NIKON TP1020荧光倒置显微镜购于日本Olympus公司，KQ-500B超声波清洗器购于上海百典仪器有限公司。

1.4 方法

第一，强化会计内控管理人员的法律意识，进行专门的法治教育，确保每一个财务内控人员都能够明确做假账等违法行为的恶劣影响，在团队内部形成良好的打假风气。同时，利用这个机会加强职业道德规范建设，提高财务内控人员的思想道德品质。第二，重视内控人员的继续教育，及时更新内控理念，强化财务管理专业知识，提高会计信息电算化操作技能。

1.4.4 Western blot 检测Sirt1蛋白的表达 取对数生长期SH-SY5Y神经细胞接种于六孔板中，每孔加入2 mL细胞悬液，细胞分组及给药同1.4.2。收集细胞加入蛋白裂解液提取总蛋白，根据 BCA蛋白定量法检测各组蛋白浓度，95 ℃灭活10 min，然后电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，将Sirt1和β-actin抗体于4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，二抗室温下孵育1 h，TBST漂洗 3次，最后ECL化学发光法显影。

1.5 统计学方法 Western blot 和线粒体膜电位数据采用Image J 软件分析。应用SPSS13.0 软件进行统计学处理，数据采用表示，各组均数之间比较进行单因素方差分析，以Student-t检验比较两组间均数的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 竹节参皂苷对SH-SY5Y神经细胞Sirt1蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组Sirt1蛋白表达显著增加；与模型组比较，竹节参皂苷组(1，5，25 μg/mL)Sirt1蛋白表达增加，具有剂量依赖性，且竹节参皂苷组(25 μg/mL)具有显著性差异。见图2。

1.4.3 JC-1探针检测SH-SY5Y神经细胞线粒体膜电位水平 取对数生长期的SH-SY5Y神经细胞接种于24孔板中，每孔1 mL，细胞分组及给药同1.4.2，每孔设置5个复孔，弃去上清液，加入JC-1染色工作液，于37 ℃ 恒温箱中孵育20 min后终止孵育，弃去工作液， JC-1 染色缓冲液漂洗两遍，弃去缓冲液，再加入JC-1染色缓冲液200 μL，于倒置荧光显微镜(400倍，视野 50 μm)下观察荧光强度。

1.4.1 细胞培养 SH-SY5Y神经细胞以含 10%胎牛血清的DMEM 完全培养基培养于 37 ℃，5% CO2培养箱中并以0.25%胰酶消化传代，选择对数生长期细胞进行试验。

1.4.2 细胞分组及给药 实验分为正常组、模型组、竹节参皂苷组(1，5，25 μg/mL)。细胞孵育24 h后，除正常组和模型组外，其余组加入相应浓度的竹节参皂苷和50 g/L的D-半乳糖，模型组单独加入50 g/L的D-半乳糖，孵育24 h，检测各项实验指标。

2 结 果

线粒体是细胞内能量产生和氧代谢的重要场所，也是内源性自由基攻击的主要场所[12]。过量的自由基损伤线粒体，影响呼吸功能并且由此增加电子流和活性氧生成，加重氧化应激和线粒体氧化损伤，从而加速衰老[13-14]。研究[15-16]表明，线粒体功能障碍是衰老相关神经退行性疾病主要病因之一。而线粒体膜电位的高低决定了线粒体功能。X.Zhu等[17]研究证明葛根素能有效抵抗谷氨酸盐对SH-SY5Y神经细胞造成的线粒体功能障碍。本实验结果表明，当D-半乳糖处理SH-SY5Y神经细胞时，线粒体膜电位显著降低，而竹节参皂苷组能提高线粒体膜电位，且具有一定剂量依赖性。提示竹节参皂苷通过改善线粒体功能从而改善SH-SY5Y神经细胞损伤。

D-半乳糖是目前国内公认的致衰剂，用其建立的动物模型已经广泛用于衰老动物模型构建和体外细胞衰老模型复制。D-半乳糖作为氧化性物质，在醛糖还原酶催化作用下，还原为半乳糖醇，不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，使蛋白质、脂质以及核酸过氧化，引起线粒体结构损伤，线粒体功能紊乱，能量代谢发生障碍，从而导致细胞损伤[9-10]。研究[11]表明，三七总皂苷联合淫羊藿总黄酮可通过改善线粒体功能明显削弱D-半乳糖所致H9C2大鼠心肌细胞衰老。

  

图1 竹节参皂苷对SH-SY5Y神经细胞线粒体膜电位的影响

本文以改性磷矿渣稳定后的Pb污染土为研究对象，通过毒性浸出试验、形态分布试验及矿物分析试验研究了不同改性磷矿渣添加量对Pb污染土浸出特性、形态分布和矿物成分影响规律，并与相同添加量的水泥稳定土做对比.研究成果可为Pb污染土稳定化修复及资源化利用提供关键的理论和参数支持.

  

图2 竹节参皂苷对SH-SY5Y神经细胞Sirt1蛋白表达的影响

3 讨 论

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2.1 竹节参皂苷对SH-SY5Y神经细胞线粒体膜电位的影响 与正常组比较，模型组中绿色荧光强度明显增强，而红色荧光微弱；与模型组比较，竹节参皂苷组(1，5，25 μg/mL)绿色荧光强度减弱，而红色荧光增强，且具有剂量依赖性。见图1。

（4）漳河水利经济规范管理情况。漳河工程管理局先后制定了生产经营单位目标管理修订办法、经营议事规则、经营性合同管理办法等一系列生产经营管理制度，通过健全完善各项管理制度，坚持用制度来规范各项管理工作，努力实现强管增效。

22例不合格标本中，1～12岁组8例（13.8%）；13～60岁组4例（3.0%）；60岁以上者10例（10.3%）。1～12岁组与13～60岁组人群比较，卡方=8.070 0，P=0.004 5，差异有显著性；60岁以上组与13～60岁组人群比较，卡方=5.301 8，P=0.021 3，差异有显著性。结果见表2。

Sirt1是一类NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，是哺乳动物中SIR2的同系物，Sirt1 广泛存在于大脑皮质、海马和小脑[18]。研究[19-21]表明，Sirt1在哺乳动物的脑神经元中高表达，在衰老过程中对维系神经元的正常功能发挥着重要的作用。Q.Sun等[22]研究表明牛磺酸通过激活Sirt1抑制淀粉样β1-42引起的SK-N-SH细胞线粒体功能障碍。本实验结果表明,与正常组比较，模型组Sirt1蛋白显著增加，与模型组比较，竹节参皂苷组Sirt1蛋白上升更明显，且竹节参皂苷组(25μg/mL)具有显著性差异，提示竹节参皂苷通过激活Sirt1抑制线粒体功能障碍从而改善D-半乳糖对SH-SY5Y神经细胞造成的损伤。

综上所述，竹节参皂苷对D-半乳糖致SH-SY5Y神经细胞损伤具有一定的保护作用，这种作用可能与激活Sirt1进而调节线粒体功能有关。

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