慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmononary disease，COPD)是以肺部小气道气流受限为特征的慢性阻塞性炎症疾病，肺功能进行性下降是其主要特征[1-2]。国内外研究[3-4]显示天然植物萃取物姜黄素有抗炎、清除活性氧自由基、抑制肿瘤细胞增殖等生物学活性，本研究通过烟熏联合脂多糖构建COPD大鼠模型，观察姜黄素对肺功能，病理形态和炎症因子等的影响，探讨姜黄素治疗COPD的可能作用机制。

例如，教师在向学生演示了水果中维生素C的还原性实验后，鼓励学生在掌握实验原理和步骤的基础上，对生活中的水果的其他元素进行实验探究，不仅能让学生在生活中巩固化学理论知识，更能让学生在实践中锻炼实验操作技能，提高学生的化学实验水平。学生在高中阶段面临着巨大的学习压力，教师如果能在教学过程中将理论知识与生活结合起来，既能加快学生对知识的理解与接受效率，又能适当缓解学生的学习难度，让学生在相对轻松的环境中进行学习，从而提高学生的学习效率。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和设备 健康成年雄性SD大鼠30只，体质量(220±20) g，购自武汉大学实验动物中心。姜黄素(质量分数>99%，泽郎，南京)； 脂多糖(Sigma，美国，1 mg/mL)，水合氯醛(武汉谷歌生物)。p38、p-p38、p-p65和p65(CST，USA)， IL-8、CRP、TNF-α和ELASA试剂盒(RD，美国)，引物(擎科生物)，逆转录仪(eppendorf)，逆转录试剂盒(GeneCopoeia,USA)，紫外分光光度计(Thermo fisher，美国)，显微镜(Olympus BX51，日本)，成像系统(HITMAS-30，日本)。

“公司高度重视进博会,积极邀请合作关系较好的外企参展,外企的参展意愿非常强烈,积极性很高,都是由公司高层管理人员带队赴上海参会。”云南云天化联合商务有限公司副总经理丁雪莲介绍,很多外国企业对中国市场都非常感兴趣,中国巨大的市场潜力对他们的吸引力很大,他们希望通过参加进博会展示自己,树立自己良好的形象,结识更多的合作伙伴。

1.2 实验动物分组 30只SD大鼠随机均分为对照组、COPD模型组和姜黄素组。采用烟雾暴露联合气道滴入脂多糖构建大鼠COPD模型。对照组正常饲养，不作特殊处理。COPD模型组和姜黄素组大鼠在第1、14天腹腔注射水合氯醛麻醉后，通过气管插管向气管内注入脂多糖200 μg /200 μL，然后将大鼠直立旋转10 s，使脂多糖均匀分布于双肺，第2～13、第15～28天将大鼠置入自制熏吸箱内，内熏香烟烟雾，30 min/次，15只/d。姜黄素组于模型构建后4周给予姜黄素灌胃30 d(200 mg·kg-1·d-1)，剂量和方法参考文献[5-6]。药物治疗满30 d后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，然后利用肺功能检测系统检测各组大鼠肺功能，并行气管插管，用PBS灌洗左侧支气管肺泡，将BALF离心、重悬，送医院检验科利用血细胞分析仪检测中性粒细胞数和中性粒细胞之比，并收集右肺和血清，-80 ℃冰箱冻存。

1.3 肺组织病理检查 取肺组织放置于4%甲醛固定48h后，石蜡包埋，切片、制片、HE染色观察肺组织病理形态。

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0软件进行分析，计量资料用表示，各组均数的比较采用单因素方差分析，组间比较采用最小显著差(LSD)t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 各组大鼠肺功能的比较 肺功能检测仪通过测定各组大鼠肺顺应性(CL)，第0.3秒用力呼气容积(FEV 0.3%)与用力肺活量(FVC)之比和用力呼气流量(MMEF)评估各组大鼠肺功能。结果显示，与对照组相比，COPD模型组大鼠CL、FEV 0.3%/FVC和MMEF均明显降低(P<0.05)；与COPD模型组相比，姜黄素组大鼠CL、FEV0.3%/FVC和MMEF均明显增高(P<0.05)。见表2。

1.4 ELISA检测血清中和BALF中炎症细胞因子表达水平 取各组血清和BALF按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测血清和BALF中IL-8、TNF-α 和CRP表达水平。

2.5 各组大鼠BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比的比较 与对照组比较，COPD模型组BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比均明显增加(P<0.05)；与COPD模型组比较，姜黄素组 BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比均明显降低(P<0.05)。见表3。

 

表1 RT-PCR引物序列

  

基因种属 正义链 反义链TNF-α大鼠ACCAAGGATG-AGGGCGACTACAGGCTTATG-CCACCACACTTIL-8大鼠TGCGCTGGGC-TTAGATCATTTGGATGCCTTT-TATGTC-GTCTCRP大鼠ACCCAAATCG-TGCGTGACATGGGGTTTACA-TTGCCGATAGβ-actin大鼠AGAGGGAAAT-CGTGCGTGACCAATAGTGAT-GACCTGGCCG

2.7 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8和CRP表达量的比较 与对照组比较，COPD模型组血清中TNF-α、IL-8和CRP表达量均明显增高(P<0.05)；与COPD模型组比较，姜黄素组血清中TNF-α、IL-8和CRP表达量均明显降低(P<0.05)。见表5。

融资工具不少，但达标的企业并不多，众多民企在银行之外融资无门。某智能装备制造企业财务部门负责人万霖介绍，有些下游企业实力不强，也没有足够的流动资金，希望通过融资租赁的方式购买他们的设备。“这原本是帮助制造企业提升销售业绩的好事，也能让小企业尽早提升制造能力，但有些机构就只做发达地区的业务，不做欠发达地区的，因为他们觉得那些地方的公司回款难、报表不漂亮、资质不足。但实际上，民企的情况千差万别，欠发达地区也有好企业。”

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况及体重增长率 对照组大鼠毛发白皙，光滑，活动性良好，无咳嗽，饮食良好，体质量增加率为(87.22±9.17)，COPD模型组大鼠毛发萎黄，大量脱落，活动性差，经常出现咳嗽，饮食明显减少，体质量增加率为(49.13±6.45)，一般情况较对照组明显变差。姜黄素组大鼠毛发少量萎黄和脱落，活动性较差，偶尔出现咳嗽，饮食欠佳，体质量增加率为(63.15±7.13)，一般情况较COPD模型组好。

2.6 各组大鼠肺脏TNF-α、CRP和 IL-8的mRNA表达的比较 与对照组比较，COPD模型组肺脏中TNF-α、CRP和IL-8的mRNA表达水平均明显增高(P<0.05)；与COPD模型组比较，姜黄素组肺脏中TNF-α、IL-8和CRP的mRNA表达水平均明显减少(P<0.05)。见表4。

 

表2 三组大鼠对CL、FEV 0.3%/FVC和MMEF的比较

  

组别CLFEV0.3%/FEVMMEF对照组0.53±0.150.93±0.104.12±0.83COPD模型组0.24±0.06*0.51±0.04*1.12±0.43*姜黄素组0.41±0.12#0.79±0.05#3.08±0.67#

注：与对照组比较，*P<0.001；COPD模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组大鼠肺组织病理形态比较 对照组肺泡结构完整，无肺气肿，肺间质和肺泡腔均无炎性细胞渗出。COPD模型组可见大量肺气肿形成，肺泡腔萎陷，大量炎症细胞浸润。姜黄素组可见少量肺气肿，散在萎缩肺泡，炎症细胞浸润明显减少，见图1。

 

注：A.对照组(×200)；B.COPD模型组(×200)；C.姜黄素组(×200)。

图1 HE检测各组大鼠肺组织病理改变的比较

2.4 各组大鼠肺脏中p38、p-p38、p-p65和p65表达水平的比较 Western blotting检测结果显示，与对照组相比，COPD模型组大鼠肺脏中p-p38和 p-p65表达明显上调(P<0.05)，而p65和p38表达水平无差异(P>0.05)；与COPD模型组相比，姜黄素组大鼠肺脏中p-p38和p-p65表达明显下调(P<0.05)，而p65和p38表达水平无差异(P>0.05)；结果显示，姜黄素可抑制p38/NF-KB信号通路激活。见图2。

 

注：与对照组比较，*P<0.001；与COPD模型组比较，#P<0.05。

图2 Western Blotting检测各组大鼠p38、p-p38、p65和p-p65表达水平的比较

1.5 RT-PCR检测肺组织炎症细胞因子信使RNA(mRNA)水平 取右肺组织，提取RNA，检测RNA含量，反转录，上样，IL-8、CRP、TNF-α引物序列如表1所示，扩增条件为：变性94 ℃(10 s)→退火59 ℃(45 s)→60 ℃(1 min)×35个循环，利用图像分析仪器上进行扫描分析，具体步骤参见文献[6]。

 

表3 各组大鼠BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比的比较

  

组别白细胞计数(×106)中性粒细胞百分比(%)对照组0.81±0.310.11±0.03COPD模型组1.48±0.35*0.65±0.08*姜黄素组1.01±0.31#0.36±0.05#

注：与对照组比较，*P<0.05；与COPD模型组比较，#P<0.05。

斗转星移，随着人民币币值稳固、外汇储备水平坚实，预计人民币国际化窗口将再次开启。预期人民币资本项目可兑换将成为自贸港内金融制度创新的核心，从而实现自贸区试点未尽目标。深入推进跨境贸易人民币结算作为自贸港金融开放创新的重要任务，将进一步扩大人民币跨境使用，继续扩大试点企业的规模。扩大跨国公司总部外汇资金集中运营管理试点企业范围，进一步简化外部资金池管理，促进贸易投资便利化。

 

表4 TNF-α、IL-8和CRP的mRNA表达水平的比较

  

组别TNF-α(mRNA)IL-8(mRNA)CRP(mRNA)对照组1.02±0.121.00±0.151.05±0.05COPD模型组13.50±1.00*8.50±0.55*4.90±0.61*姜黄素组5.50±0.55#5.00±0.25#2.40±0.35#

注：与对照组比较，*P<0.05；与COPD模型组比较，#P<0.05。

1.6 Western blotting检测肺组织蛋白表达 取肺组织，提取总蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按说明书进行Western blotting实验，检测p38、p-p38、p-p65和p65表达。最后采用ECL试剂盒显影并成像。每组实验重复3次，具体步骤参见文献[7]。

 

表5 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8和CRP表达量的比较

  

组别TNF-α(pg/mL)IL-8(pg/mL)CRP(pg/mL)对照组115±10100±15105±10COPD模型组1300±250*450±50*850±100*姜黄素组650±55#260±30#550±50#

注：与对照组比较，*P<0.05； 与COPD模型组比较，#P<0.05。

2.8 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-8和 CRP表达量的比较 与对照组比较，COPD模型组BALF中TNF-α、IL-8和CRP表达量均明显增高(P<0.05)；与COPD模型组比较，姜黄素组BALF中TNF-α、IL-6和CRP表达量均明显降低(P<0.05)。见表6。

 

表6 各组大鼠中TNF-α、IL-8和CRP表达量的比较

  

组别TNF-α(pg/mL)IL-8(pg/mL)CRP(pg/mL)对照组1.25±0.241.23±0.111.03±0.12COPD模型组8.56±1.34*3.86±0.49*4.75±0.45*姜黄素组4.28±0.51#1.85±0.22#2.16±0.31#

注：与对照组比较，*P<0.05；与COPD模型组比较，#P<0.05。

3 讨 论

COPD是以气道、肺血管和肺实质慢性炎症为典型特征的肺部疾病，其主要致病因素为反复的呼吸道感染，典型病理改变包括阻塞性细支炎、肺气肿、肺血管病变和肺功能受损等[1-2]。本研究通过烟熏联合脂多糖构建大鼠COPD模型。结果显示COPD大鼠一般状况差，体质量增加率明显降低；肺功能检测显示CL，FEV 0.3%/FVC和MMEF均明显降低，提示COPD大鼠肺顺应性明显降低，气道阻力明显增高，气流严重受限，严重影响肺通气和换气功能，病理显示可见COPD大鼠大量肺气肿形成，肺泡腔萎陷，大量炎症细胞浸润，符合既往研究[1-2]显示的COPD大鼠病理生理特征。

COPD的气道炎症以中性粒细胞淋巴细胞和肺泡巨噬细胞浸润为主，被激活的炎性细胞可释放多种炎症介质和细胞因子，可直接参与气道炎症的发生发展。IL-8能趋化、激活白细胞，减少中性粒细胞的凋亡，对COPD气道炎症的发生、维持、甚至加重起重要作用[7]。TNF-α可增强白细胞介导的免疫反应，促进巨噬细胞释放多种炎症介质和细胞因子，扩大炎症反应，引发组织受损。CRP是一种可对损伤，感染等多刺激做出迅捷反应的蛋白，是反映炎症和组织损伤的敏感指标[7-9]。本研究结果显示，与对照组相比，COPD模型组血清、BALF和肺组织中IL-8、CRP和TNF-α表达水平以及BALF中性粒细胞总数和中性粒细胞比均明显升高，提示COPD除引起严重的肺实质和气道炎症外，还引发严重的全身炎症，这与国内外多项研究报道相一致。而姜黄素治疗可明显减少血清，BALF和肺组织中IL-8、CRP和TNF-α的表达水平以及BALF中性粒细胞总数和中性粒细胞之比，提示姜黄素不但可减轻COPD引起的肺实质和气道炎症，还可减轻COPD引起的全身炎症，但具体机制不明。核因子KB(NF-KB)信号途径受上游各种信号刺激分子而激活，如p38分子等。磷酸化修饰激活p38可通过磷酸化NF-KB上游的抑制蛋白IKB等，促使p65迁徙入细胞核，进而诱导TNF-α、IL-8和CRP等炎症因子的表达。既往有大量研究[10-11]显示NF-KB介导的炎症信号通路与吸烟引发的气道炎症以及COPD密切关联，因此抑制p38/ NF-KB信号通路介导的炎症能减轻COPD。本研究结果中COPD模型组p-p38和p-p65表达明显上调，进一步证实了p38/NF-KB信号通路的激活与COPD密切相关，而姜黄素可减少p-p38和p-p65的表达，因此，姜黄素能通过抑制p38/NF-KB信号通路介导的炎症而改善COPD。

生活中的你，是一个很有内涵的人，富有学识和修养，给人以文质彬彬的印象。你是一个蛮有抱负的人，对未来的生活有追求，为此你会做好规划，按部就班地朝着自己的既定目标去努力。在和别人共事的过程中，你时常有许多不错的创意和想法，因为你的存在，一些已经停滞不前的工作可以继续推进，得以顺利完成。但有的时候，你也会显得比较固执，坚信自己的意见是正确的，不容置疑的，这会让你周围的人觉得和你不太好相处和沟通，除非你能够自己想通，别人几乎无法改变你的想法。

综上所述，姜黄素可减轻COPD，其作用机制与抑制p38/NF-KB信号通路介导的炎症反应相关。但是否还有其他信号途径参与姜黄素改善COPD，尚需进一步研究。

参考文献

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[2] Craig PH.Pharmacogenetics of chronic obstructive pulmonary disease：challenges and opportunities[J].Pharmacogenomics，2010，11(2)：237-247.

[3] Subash CG,Sridevi P,Wonil K.Discovery of curcumina component of the golden spice and Its miraculous biological activities[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39(3)：283-299.

[4] Subash CG,Sridevi P,Bharat B,et al.Therapeutic roles of curcumin：lessons learned from clinical trials[J].AAPS J，2013,15(1)：195-218.

[5] 方苏榕，谷伟，谭焰，等.烟熏联合内毒素构建COPD 大鼠模型[J].南京医科大学学报：自然科学版，2013,33(9)：1226-1229.

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[11] Byung-Wook Kim,Sandeep Vasant More,Yo-Sep Yun,et al.A novel synthetic compound MCAP suppresses LPS-induced murine microglial activation in vitro via inhibiting NF-kB and p38 MAPK pathways[J].Acta Pharmacol Sin，2016,37(3)：334-343.