根据世界卫生组织统计，全球丙型肝炎病毒(HCV)的感染率约2.8%。聚乙二醇干扰素联合利巴韦林(PR)治疗方案是我国现阶段HCV感染者接受抗病毒治疗的主要方案，对PR方案进行深入研究，特别是对抗病毒治疗前后机体免疫功能变化的研究，对临床治疗观察及方案优化是有积极意义的。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集由大连市第六人民医院2015年8月至2016年9月招募入组的19例慢性丙型肝炎患者为慢性丙肝组，其中男10例，女9例，年龄23～79岁，平均(46.16±15.09)岁；收集由大连医科大学附属第二医院2016年5至2016年10月招募入组的健康受试者20名为对照组，其中男11名，女9名，年龄23～77岁，平均(46.00±11.91)岁。本资料中慢性丙型肝炎患者均符合2015年《丙型肝炎防治指南》慢性丙型肝炎的诊断标准，排除与HBV混合感染及与HIV混合感染的患者，排除有严重肝功能障碍、严重心脏病史及严重精神病史患者，排除妊娠及哺乳期的患者，排除未经抗病毒治疗的初治成年患者。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 治疗方案 采用PR治疗方案：聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)α-2a 180 μg，皮下注射，1次/周；利巴韦林15 mg· kg-1·d-1，口服，基本疗程为48周，根据治疗前与治疗后的第4周，第12周，第24周，第48周检测HCV RNA以评估病毒应答指导治疗。

1.3 观察指标 分别于聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)α-2a联合利巴韦林的治疗前(基线)与治疗后第4周，第12周，第24周，第48周检测慢性丙肝组患者HCV-RNA、肝功能、CD4+的Treg细胞及Th17细胞。检测对照组肝功能、CD4+的Treg细胞及Th17细胞。

长期以来，变电站建设沿用的是就地采购砂石、砖、钢筋、水泥等建筑材料，现场捆绑钢筋，搅拌混凝土、浇筑、养护、填充、粉刷的传统模式。这种施工模式往往会因作业队伍技术水平参差不齐而使得工程质量受到影响。在国家电网公司“三通一标”和“两型一化”中，对变电站建设提出了更高的要求，工业化、模块化、标准化的装配式建构筑物将成为变电站建设发展的方向。

2.3 治疗前后慢性丙肝组患者与对照组CD4+的Treg、Th17细胞百分率比值变化的比较 与对照组相比，慢性丙肝组患者CD4+的Treg、Th17细胞百分率比值明显减低(P=0.000，P<0.05)，抗病毒治疗后，比值明显增高，与对照组相比差异无统计学意义(P=0.403，P>0.05)，第12、24、48周检测无反复。见表2。

1.5 主要试剂 FOXP3-PE,CD4-FITC,CD25-APC,PE Rat IgG2a ,IL-17-PE单抗购自COULTER公司，鼠FITC-IgG1/PE-IgG1单抗为Pharming公司产品。Fixation/Permeabilization、Fixation/Permeabilization Diluent、Permeabilization Buffer (10X) 购自eBioscience公司。

1.6.3 CD4+的Th17细胞检测 (1)分别拿两支试管并对其编号；将相应患者使用肝素抗凝的外周血100 μL分别加入到相应编号的试管中，充分摇匀，同时分别加入0.5 mL PMA于37 ℃水浴保存6 h；(2)另取两只试管并编号，将步骤(1)中两管各取200 μL加入到相应编号为C、D的试管中并同时加入20 μL CD4-FITC混匀，室温避光保存15～30 min(可根据实验所处环境，参考试剂相应说明书，调整抗体使用情况)；(3)加入1 mL新鲜制备的e Bioscience /Demobilization应用液混匀，室温避光保存30 min；(4)取出试管后，分别加入用稀释液稀释10倍的Demobilization Buffer洗液2 mL ，使用离心机1 500 r/min离心5 min，然后充分弃去上清液，按照上述方法与步骤再清洗三遍；(5)C管加入10 μL IL-17-PE标记的抗体和10 μL IFN-r-FITC，D管加入5 μL rat IgG2a与10Μlbd混匀放4 ℃孵育箱避光孵育3 h；(6)取出试管，同步骤(4)洗两遍后充分弃去上清，同时相应加入1 mL PBS或去离子水，保证在1.5 h内上机实验。

1.6.1 HCV-RNA定量 应用COBAS Ampliprep仪，采用实时荧光定量RT-PCR方法检测，检测下限为15 IU/mL。

为了确保DSC报警系统全天候的工作,从应急通信的层面为海上的救助提供坚强的保障，履行国家赋予海岸电台的重要职责，对海岸电台的供电系统重新的规划改造成为必要，主要是彻底完善发信台的应急供电系统，达到万无一失。设计构想是配套两个应急电源供电，当一个电源发生故障时，另外一个电源不应同时受到损坏。为了保证系统正常运行，设计的方案是在发信台保留原来的柴油发电机等供配电设备，增加配置UPS，具体配置见表1。

1.6.2 CD4+的Treg细胞检测 取两支试管，加入100 μL外周血(混匀)；两支管中加入20 μL CD4/25,混匀，室温避光15～30 min(具体抗体情况及用量，请参考试剂相应说明书)；然后，加入1 mL 新鲜制备的eBioscience Fixation/Permeabilization应用液，混匀，室温避光30 min；取出后再用2 mL Permeabilization Buffer洗两遍，弃掉上清；两支管中加入2 μL normal rat serum，避光孵育15 min；取出后不洗，直接加入5 μL Foxp3-PE标记的抗体和1 μL rat IgG2b同型对照，混匀放4 ℃避光孵育30 min～3 h；取出试管用2 mL Permeabilization Buffer洗两遍，1 200 r/min离心5 min；弃掉上清，加入0.5 mL PBS，保证在1 h内上机实验。

1.6 检测方法

新课改背景下，小学课本相应地做了些调整，内容布置更加科学，比较符合学生们的学习。并且，教育部比较重视生活化教育问题，新课本里面就被编排了一些生活情境，帮助学生们了解生活，走进生活，让孩子们知道学习是与生活分不开的，进而让孩子们喜欢上小学数学，同时热爱上生活。以往的作业练习只是关注对于计算的巩固，根本毫无生活气息，死板、无聊的数学计算让孩子们无法产生对于学习数学的兴趣。那么开放性、生活性的数学作业和平时生活密切相连，完全可以调动起孩子们的积极性，让孩子们牢牢掌握所学知识内容。

2.2 慢性丙肝组治疗前后与对照组CD4+的Treg、Th17细胞变化比较 与对照组相比，慢性丙肝组患者Treg、Th17细胞百分率明显升高(P=0.000，P<0.05)，抗病毒治疗后，Treg、Th17细胞比率明显下降，于第12周时与对照组比较差异无统计学意义(P=0.525，0.575，P>0.05)，第24周和第48周检测无反复。见表1。

2 结 果

2.1 典型流式图

2.1.1 Treg细胞的界定 流式分析设门运用CD4+ CD25+ FoxP3+来定义Treg(图1)。

不同反应时间制备样品技术指标见表4。表4数据显示，反应时间分布在60～300 min之间，制备样品的钼含量分布在42.23%～52.67%之间，氨不溶钼分布在0.35%～1.68%之间，其他杂质含量随着反应时间延长均有不同程度的降低。

  

图1 Treg细胞

 

发现用户的真正需求是小型专项农具人性化设计的基础。科学的调研是把握用户需求的最佳方法。根据调研对象的特点，必须考虑调研方法选择的针对性。考虑到农民的表述能力、方言特点、通信状况等实际条件，访谈调研可靠性更强，所获得信息更具参考价值。根据我国幅员辽阔，相同专项农业劳动的环境差异较大和要求不同的特点，对于调研对象的抽样也要追求全面性和代表性，要让调研数据充分体现不同环境下作业的具体需求。

  

图2 Th17细胞

1.7 统计学方法 使用SPSS 20.0软件对数据进行统计处理，数据用表示，计量资料采用t检验或秩和检验，计数资料采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表1 外周血CD4+细胞Treg、Th17细胞百分率变化的比较

  

组别nTreg细胞Th17细胞对照组205.05±0.451.20±0.12慢性丙肝组 治疗前197.56±1.322.11±0.55 治疗第4周175.54±0.581.35±0.20 治疗第12周175.18±0.801.24±0.33 治疗第24周144.88±0.341.16±0.84 治疗第48周174.89±0.331.17±0.08

1.4 仪器和设备 BD FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)、YS72 5KVA净化式交流稳压电源(中国上海科技仪器仪表厂) 、HH·W21·600-S电热数显恒温水浴箱(中国跃进医疗器械厂)。

本文以秸秆灰渣作为吸附材料，对不同染液进行了吸附试验，研究在不同实验条件下的秸秆灰渣的吸附性能[1-4]，与活性炭吸附性能进行了比较研究。旨在寻找一种廉价环保吸附材料，替代或部分替代高耗能高耗材的活性炭吸附剂，同时使秸秆灰渣得以利用，减少环境污染。

2.1.2 Th17细胞的界定 流式分析设门运用CD4+ IL-17+来定义Th17细胞(图2)。

 

表2 CD4+的细胞Treg细胞百分率与Th17细胞百分率比值变化的比较

  

组别nTreg细胞/Th17细胞对照组204.257±0.45 慢性丙肝组治疗前193.66±0.42治疗第4周174.14±0.35治疗第12周174.27±0.43治疗第24周144.21±0.23治疗第48周174.20±0.17

2.4 慢性丙肝组患者治疗前(基线)HCV-RNA含量和ALT与Treg、Th17细胞线性关系 HCV-RNA含量与Treg、Th17细胞线性回归P值分别为0.006和0.007，均具有统计学意义(P<0.05)，HCV-RNA含量与Treg细胞百分率拟合曲线见图3、与Th17细胞百分率拟合曲线见图4；ALT含量与Treg、Th17细胞线性回归P值分别为0.306和0.319，均没有统计学意义(P>0.05)，ALT含量与Treg细胞百分率拟合曲线见图5，ALT含量与Th17细胞百分率拟合曲线见图6。

3 讨 论

HCV感染是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因，由于HCV的基因组变异性高，对其细胞免疫和体液免疫在HCV感染及恢复和治疗中的作用认识仍然不是十分清楚， Treg 细胞(CD4+CD25+Foxp3+)是一种免疫抑制调节细胞，机体在感染HCV病毒后，其活性增强，通过分泌细胞转化生长因子β(TGF-β)、IL-10、IL-35等抑制性因子从而抑制HCV特异性细胞毒细胞的增殖及γ-IFN、穿孔素的形成，导致HCV病毒不能被机体快速的清除[1-2]。CD4+的Th17细胞在介导炎症、自身免疫反应方面起着重要的作用，一方面机体由于感染了HCV的肝实质细胞释放的胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)刺激了Th17细胞的分化，Th17 细胞的增加又促进了肝细胞的炎症和肝硬化的发生，Th17细胞的增加通过其分泌的IL-17抑制肝细胞凋亡，感染 HCV 的肝细胞得以存活[3-5]，另一方面，HCV患者抗原特异性Th17细胞由IL-10和TGF-β调节，HCV特异性Th17细胞由IL-10由病毒诱导的TGF-β抑制，患者外周血的IL-17、IFN-r、IL-10及TGF-β均增高，并且Treg与Th17可以互相转化，这就是Th17表达率的多样性[6-8]。PEG-IFN α-2a是聚乙二醇(PEG)与重组干扰素α-2a结合形成的长效干扰素。干扰素与细胞表面的特异性受体结合，触发细胞内复杂的信号传递途径并迅速激活基因转录，调节多种生物效应，包括抑制感染细胞内的病毒复制，抑制细胞增殖，并具有免疫调节作用。PEG-IFN α-2a联合利巴韦林(RBV)是目前HCV抗病毒治疗的标准方案，约65%患者可取得持续病毒学应答持久抑制HCV复制是慢性丙肝的重要治疗目标。

本资料中慢丙肝受试者CD4+细胞中Treg百分率较对照组明显增高，随着治疗的进行，在12周的时候与对照组比较差异已经无统计学意义(P>0.05)，说明在抗病毒治疗有效的情况下，Treg细胞随着病毒载量的减少而减少，此结论及基线测定HCV-RNA与Treg细胞的时候就发现Treg细胞与病毒的载量呈正相关。同时慢丙肝受试者CD4+细胞中Th17细胞百分率与对照组也明显增高，其表达率变化方式与Treg基本相同，但Treg与Th17细胞百分率比值却不尽相同，基线与对照组比明显增高，抗病毒治疗后于第4周恢复与对照组比较无显著性差异无统计学意义(P>0.05)，说明Treg细胞与Th17 的细胞百分率比值比单独检测其两个指标更能反应机体对抗病毒治疗效果的反应。

综上所述，本资料结果能够反映出慢性丙型肝炎患者治疗过程中机体两种免疫细胞的变化，对治疗的监控及预后的判读有着积极的作用。

(本文图1、图3～图6见封三)

参考文献

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[6] Fernandez-Ponce C，Dominguez-Villar M，Aguado E，et al.CD4+ primary T cells expressing HCV-Core protein upregulate foxp3 and IL-10，Suppressing CD4and CD8T cells[ J]． PLoS One，2014，9(1)：e85191.

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[8] Fabre T，Kared H，Friedman SL，et al．IL-17A enhances the expression of profibrotic genes through upregulation of the TGF-β receptor on hepatic stellate cells in a JNK-dependent manner[J]． J Immunol，2014，193(8)：3925-3933.