干眼是眼科门诊相当常见的疾病之一，2013年1月中华医学会眼科学分会角膜病学组对干眼作了新的定义：即干眼是泪液的量或质或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和(或)眼表损害,从而导致眼不适症状及视功能障碍的一类疾病[1]。干眼是多因素相互作用的结果。包括诸如基于免疫炎症反应的干燥综合症,更年期妇女的性激素水平下降,及长期应用眼科药物对泪膜的损伤。

中医学认为“肝在液为泪”，肝所受藏的精微物质输送于目，使目受滋养,从而维持正常的视觉功能。逍生散是谢立科主任医师创制，疏肝养阴法治疗干眼症，取得一定的动物实验结果与临床疗效[2-3]。本研究旨在进一步探讨逍生散治疗干眼的作用及分子作用机制，为干眼的中医治疗提供新思路和客观依据。

从公安局被保释回家的关小美，挺着大肚子，在父母面前失声痛哭。关云飞追悔莫及，他唉声叹气地说：“女儿，都怪爸爸太专行独断，是我害了你们啊！其实，爸爸对你也是一片苦心啊，我之所以处处给郭启明设置‘障碍’，是想让他知难而退，没想到他竟然做出这种事来。其实他把32万首付房款的银行卡递到我手上时候，我已经开始从内心接纳这个小伙子了。早知如此，我还不如让你们顺顺当当结婚……”

1　材料和方法

1.1　材料

Wistar大鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。人角膜上皮(ATCC®CRL-11515TM)：美国标准生物品收藏中心。

1.2　药物和试剂

逍生散颗粒剂主要组成：党参10 g、当归10 g、生地黄20 g、白芍20 g、麦冬10 g、五味子10 g、柴胡8 g、薄荷8 g，参考《药理实验方法学》与人折算，大鼠剂量即按照成人日剂量的6.36倍分冲备用；苯扎氯胺：Sigma公司；CCK-8：日本同仁化学研究所；10x Ex taqTM buffer(Mg2+ free)：日本Takara公司；TaKaRa Ex TaqRHot Start Version：日本Takara公司。

1.3　方法

1.3.1　干眼角膜上皮细胞损伤模型的制备　对数生长期的细胞，以1×10 5/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，培养24小时后，更换新的培养液，加入1 μg/mL浓度的苯扎氯胺作用于细胞，制备得干眼角膜上皮细胞损伤模型。

在48小时、72小时两个时间点，流式细胞仪分析显示逍生散中、高剂量组较模型组可减少细胞凋亡。

学校以践行社会主义核心价值观为统领，通过开展核心价值观学习教育、“中国梦”主题教育、“延安精神”进校园、爱国主义和传统文化教育、经典诵读、法制宣传教育等六项措施，以培育“四有”新人为目标，积极促进青少年健康成长，有效提升青少年的思想道德修养。

1.3.2　逍生散含药血清的制备　成年雄性Wistar大鼠30只，SPF级，体重220～240 g/只，于中国中医科学院眼科医院实验动物中心屏障级动物房内，自由摄食饮水，适应性喂养2天，禁食12小时后，给予逍生散颗粒剂蒸馏水冲服灌胃。每天2次，连续3天。末次灌胃l小时后开始采血。采用腹主动脉采血法，血液入15 mL离心管，室温静置1小时，待有血清析出后，3000 rpm离心15分钟。分离血清，56℃水浴灭活40分钟，0.22 μm滤膜过滤除菌。-20 ℃保存备用。

1.3.4　酶标仪检测角膜上皮细胞活性　对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，培养24小时后剥夺血清、弃上液，加入MEM培养液继续培养12小时，去MEM培养液后随机分为5组，除正常组外，其余各组加入1 μg/mL浓度的苯扎氯胺作用于细胞，再分别加入体积比为10%的空白血清和2.5%、5%、10%的逍生散含药血清作用于细胞，以正常条件培养的细胞做为对照，分别于作用细胞24小时、48小时、72小时后，每孔加入10 uL CCK-8继续培养1.5小时，酶标仪450 nm波长处测定各孔OD值。

1.3.3　实验分组　正常组：正常条件培养的角膜上皮细胞；空白血清组：模型细胞，加入10%空白血清；逍生散含药血清低剂量组(中药低剂量组)：模型细胞，加入2.5%逍生散含药血清；逍生散含药血清中剂量组(中药中剂量组)：模型细胞，加入5%逍生散含药血清；逍生散含药血清高剂量组(中药高剂量组)：模型细胞，加入10%逍生散含药血清。

从200名消费者中筛选招募57名年龄为20～55周岁的汉族女性，平均年龄为32周岁，其中干性肌肤和中性肌肤消费者29名，混合性和油性肌肤消费者28名。主要排除条件为：有严重系统疾病或近2年内发生过化妆品过敏现象；正处于孕期、哺乳期或者备孕期；正在参与其他临床研究项目；日晒时间较长的户外工作者；近3个月内接受过其他美容护理或其他影响测试的因素。

选取我院2014年2月～2016年6月收治的KOA患者90例，随机分为对照组与观察组，各45例。两组一般资料经统计学处理，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3.5　流式细胞仪检测角膜上皮细胞凋亡　对数生长期的角膜上皮细胞接种于24孔板内，将各处理组细胞消化成悬浮状态(EDTA)，移至离心管，冷PBS洗涤后离心，弃上清，PBS重悬后再离心，弃PBS。加入1 mL PI和Annexin V 复合液染色，室温避光30分钟。流式细胞仪检测，分析结果。

三个时间点内，模型组细胞出现不同程度的肿胀、体积增大，细胞松解、细胞间隙变大，细胞脱壁漂浮形状变圆，最终溶解、坏死。可见逍生散中、高剂量组能明显抑制细胞体积增大、细胞松解及间隙变大，减少细胞脱壁及溶解、坏死。

 

表1　检测各个目的基因的引物、探针的序列

  

各基因对应序列序列(5’-3’)产物大小(bp)β⁃Actin71　引物正向序列CCCTGGCACCCAGCAC　引物反向序列GCCGATCCACACGGAGTAC　探针序列ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCIL⁃172　引物正向序列CTGTCTCTGAATCAGAAATCCTTCT　引物反向序列AGATTGATCCATGCAGCCTT　探针序列TGTAAGCTATGGCCCACTCCATGAAIL⁃6105　引物正向序列ACCTCTTCAGAACGAATTGACAAAC　引物反向序列TTTGCTGCTTTCACACATGTTACTC　探针序列TCGGTACATCCTCGACGGCATCTCATNF⁃α72　引物正向序列CCCATGTGCTCCTCACCCA　引物反向序列CAGAGAGGAGGTTGACCTTGGTCT　探针序列CGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAMMP⁃9227　引物正向序列TTCGACGATGACGAGTTGTG　引物反向序列TGGGTGTAGAGTCTCTCGCTG　探针序列CAAGGGCGTCGTGGTTCCAACTC

 

注：A：24h模型组；B：24h中药中剂量组；C：24h中药高剂量组；D：48h模型组；E：48h中药中剂量组；F：48h中药高剂量组；G：72h模型组；H：72h中药中剂量组；I：72h中药高剂量组。

图1　24小时、48小时、72小时各细胞组给药前后光镜下观察(×400)

1.4　统计学处理

全部数据运用SAS 9.3统计软件包进行方差分析(正态、方差齐性)或Kruskal Wallis秩和检验(非正态、方差不齐)，组内比较采用配对t检验或配对秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.4.4　MMP-9相对表达量分析　方差分析对MMP-9相对表达量的组间差异进行比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较分析结果显示，中药中、高剂量组的结果相对较低(P<0.05)，见表7。

2　结果

2.1　光学显微镜观察

1.3.6　RT-PCR检测角膜上皮细胞中炎症细胞因子mRNA 的表达　提取总RNA后置于-80℃保存。用TAKARA公司的Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行操作，获取第一链cDNA，保存于-20℃备用。检索基因信息于GenBank中，由上海吉玛公司设计并合成各个基因的引物对及探针，具体序列及扩增产物大小见表1。使用TaqMan探针两步法对各目的基因进行检测。PCR数据计算方法采用2-△△CT 法，计算4个炎症因子相对于内参基因β-Actin的表达量，公式为：Fc=2-△△CT，其中△△CT =A-B。(A为对照组目的基因平均CT值-对照组内参基因平均CT值；B为实验组目的基因平均CT值-实验组内参基因平均CT值)。

2.2　细胞活性检测

采用方差分析对24小时、48小时、72小时总体的组间差异进行比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)； LSD两两比较的结果表明：中药中、高剂量组的细胞活性值和其他组差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、表3。

 

表2　细胞活性值的总体比较

  

变异来源自由度离均差平方和均方F值P值24h组间40．220．0613．27<．0001组内200．080．00总变异240．3048h组间40．340．095．330．0044组内200．320．02总变异240．6672h组间40．350．098．440．0004组内200．210．01总变异240．55合计组间427．534．59389．11<．0001组内700．800．01总变异7428．33

2.3　细胞凋亡检测

随着我国高速公路工程行业的迅猛发展，在高速公路施工中科学、合理地运用预应力管桩的施工技术，不但可以为施工企业节约施工成本，使企业获得更多的社会与经济效益，而且可以确保高速公路桥梁工程的稳固性和整体安全性，从而保证工程的施工质量。

2.4　Real Time PCR检测

2.4.1　IL-1相对表达量分析　方差分析对IL-1相对表达量的组间差异进行比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较结果显示，正常组、中药中、高剂量组的结果相对较低(P<0.05)，见表4。

 

注：A：24h模型组；B：24h中药中剂量组；C：24h中药高剂量组；D：48h模型组；E：48h中药中剂量组；F：48h中药高剂量组。

图2　48小时、72小时各细胞组给药后凋亡检测

2.4.3　TNF-α相对表达量分析　方差分析对TNF-α相对表达量的组间差异进行比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较分析结果显示，中药中、高剂量组的结果相对较低，(P<0.05)，见表6。

2.4.2　IL-6相对表达量分析　方差分析对IL-6相对表达量的组间差异进行比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较分析结果显示，中药中、高剂量组的结果相对较低，(P<0.05)，见表5。

目前,西药的种类非常多,并且还不断有新药被研制出来,临床医护人员要熟悉西药的副作用、成分、药理作用等知识,在为患者制定用药方案的时候要综合分析患者的情况后制定科学合理的用药计划[4]。在临床中,如果没有必要采取西药联用的方法治疗就不要联合用药,以减少不良反应的发生几率,确保患者用药安全[5]。

3　讨论

中医学认为肝开窍于目，脾主运化水湿，肺为水之上源，肾主水、主气化。故本病的脏腑病因与肝、脾、肺、肾相关，其病位在风轮、肉轮、气轮。《灵枢》中记载“五脏六腑之津液，尽上渗于目”，泪液属津液部分，各种原因引起泪液减少即津亏，因此阴津亏虚是本病的主要致病因素。肝气条达，阴津充沛，则目窍得养，睛珠润泽[4]。逍生散是在经方逍遥散和生脉饮的基础上，提取重点作用药物而成，主要药物组成为柴胡、党参、生地黄、麦冬、白芍、当归、五味子、薄荷，共奏疏肝养阴之功，使肝气条达，阴津充沛，则目窍得养，睛珠润泽。

 

表3　细胞活性值的分布及两两比较

  

时间与分组nMeanSDMedianQ1Q3MinMaxLSD24h　正常50．690．080．610．820．680．640．72A　模型50．500．070．370．560．510．500．53B　中药低50．550．040．510．600．560．520．58B　中药中50．490．050．420．540．480．470．52B　中药高50．700．070．620．820．690．670．72A48h　正常51．140．140．981．321．171．031．20A　模型50．860．160．771．150．810．780．81B　中药低50．860．140．741．070．870．740．89B　中药中51．110．031．051．141．111．101．13C　中药高51．000．120．861．171．000．911．06B72h　正常52．170．111．992．262．202．162．23A　模型51．870．121．762．001．851．761．99C　中药低51．890．051．821．941．911．861．91C　中药中52．000．141．752．082．062．042．07B　中药高52．110．062．022．162．142．092．15A

 

续表　续表

  

时间与分组nMeanSDMedianQ1Q3MinMaxLSD合计　正常151．330．651．170．722．160．612．26A　模型151．080．610．810．531．760．372．00C　中药低151．100．600．870．581．860．511．94B　中药中151．200．651．110．522．040．422．08B　中药高151．270．631．000．722．090．622．16A

 

表4　IL-1相对表达量的分布比较

  

检测时间与分组nMeanSDMedianQ1Q3MinMaxLSD24h　正常31．000．001．001．001．001．001．00REF　模型31．220．021．211．241．221．211．24A　中药低31．160．041．121．191．161．121．19B　中药中31．060．021．051．081．061．051．08C　中药高31．020．011．011．021．021．011．02D48h　正常31．000．001．001．001．001．001．00REF　模型31．340．021．321．351．341．321．35A　中药低31．280．021．261．291．281．261．29B　中药中31．110．021．091．131．101．091．13C　中药高31．050．031．021．071．061．021．07D72h　正常31．000．001．001．001．001．001．00REF　模型31．740．021．721．761．751．721．76A　中药低31．660．021．641．681．651．641．68B　中药中31．270．011．261．281．271．261．28C　中药高31．120．021．101．141．131．101．14D

 

表5　IL-6相对表达量的分布比较

  

检测时间与分组nMeanSDMedianQ1Q3MinMaxLSD24h　正常31．000．001．001．001．001．001．00E　模型32．220．022．202．242．222．202．24A　中药低31．830．031．801．861．831．801．86B　中药中31．410．011．401．421．411．401．42C　中药高31．340．021．321．361．351．321．36D48h　正常31．000．001．001．001．001．001．00E　模型32．330．022．312．352．322．312．35A　中药低31．880．021．861．901．891．861．90B　中药中31．530．031．501．561．521．501．56C　中药高31．450．021．431．461．451．431．46D72h　正常31．000．001．001．001．001．001．00E　模型32．660．092．602．762．622．602．76A　中药低31．980．021．962．001．971．962．00B　中药中31．620．031．601．651．621．601．65C　中药高31．550．021．531．561．561．531．56C

 

表6　TNF-α相对表达量的分布比较

  

检测时间与分组nMeanSDMedianQ1Q3MinMaxLSD24h　正常31．000．001．001．001．001．001．00D　模型31．320．011．311．331．321．311．33A　中药低31．250．031．221．281．261．221．28B　中药中31．150．011．141．161．151．141．16C　中药高31．130．011．121．131．131．121．13C48h　正常31．000．001．001．001．001．001．00E　模型31．430．031．401．461．431．401．46A　中药低31．350．031．321．381．361．321．38B　中药中31．250．021．231．261．251．231．26C　中药高31．180．021．161．201．171．161．20D72h　正常31．000．001．001．001．001．001．00E　模型31．560．031．531．581．561．531．58A　中药低31．480．021．461．501．481．461．50B　中药中31．290．011．281．301．291．281．30C　中药高31．220．021．201．241．231．201．24D

 

表7　MMP-9相对表达量的分布比较

  

检测时间与分组nMeanSDMedianQ1Q3MinMaxLSD24h　正常1．000．001．001．001．001．001．001．00C　模型1．210．021．201．231．211．201．231．21A　中药低1．160．041．121．191．181．121．191．16B　中药中1．050．011．041．061．051．041．061．05C　中药高1．020．011．021．031．021．021．031．02C48h　正常1．000．001．001．001．001．001．001．00D　模型1．320．021．301．331．321．301．331．32A　中药低1．250．031．221．281．261．221．281．25B　中药中1．140．021．121．161．131．121．161．14C　中药高1．080．021．061．101．081．061．101．08D72h　正常1．000．001．001．001．001．001．001．00E　模型1．450．031．421．471．461．421．471．45A　中药低1．380．021．361．401．381．361．401．38B　中药中1．190．011．191．201．191．191．201．19C　中药高1．110．021．101．131．111．101．131．11D

逍生散各组成药物现代药理学研究显示：柴胡总苷对很多炎症过程包括渗出、炎症介质释放等都有影响，同时对机体的特异性及非特异性免疫功能都有一定的调节作用,并且呈剂量依赖性[5]。有动物实验证实党参能增强小鼠巨唾细胞的吞噬活性,从而增强机体的免疫反应[6]。生地有明显增强产生白细胞介素-2 (IL-2)的作用,从而促使低下的细胞免疫功能增强[7]。白芍中的有效成分能调节T淋巴细胞及B淋巴细胞功能，显著抑制IL-1、TNF-α、前列腺素E(PGE)、白三稀(LTB)等与疼痛有关的细胞因子的高水平表达，起到抗炎的作用[8]。麦冬多糖具有免疫活性,能够促进体液和细胞免疫功能,并诱生多种细胞因子,提高血清溶血素的抗体水平[9]。有动物实验表明当归能促进IL-2、TNF-γ等细胞因子的表达,并能提高放射损伤小鼠的免疫功能[10]。五味子能增加免疫抑制,促进淋巴细胞转化[11]。薄荷醇是薄荷的主要有效成分,其有明显的抗炎作用[12]。

目前研究认为, 非感染性炎症是干眼发病的重要因素。近年来关于泪腺、泪液以及结膜内炎症细胞和炎症介质等免疫因素的研究发现：多种类型干眼的泪腺组织及结膜组织中T细胞增高, MHC -II及HLA-DR阳性细胞增高, 结膜组织以及泪液中炎症因子IL-1、TNF-α、MMP-9等含量增高[13], 均提示炎症因子在干眼发病中起重要作用。干眼与T细胞介导的的眼表炎症有关,炎症因子在角膜上皮细胞中高表达,参与免疫细胞向角结膜的聚集,导致了炎症的不断循环[14]。有临床实验检测干眼患者与正常人泪液中TNF-ɑ的含量[15],结果发现正常人泪液中未见TNF-ɑ的表达,而干眼患者的泪液中有TNF-ɑ表达,且泪液中TNF-ɑ的含量与角膜上皮的损伤程度呈正相关,提示TNF-ɑ是干眼发病过程中的重要致炎因子。

本研究用逍生散干预干眼角膜上皮细胞损伤模型，结果显示：逍生散中、高剂量组能增加细胞活性，减少细胞凋亡，能够降低炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α及MMP-9的表达。IL-1是由激活的单核巨嘘细胞和上皮细胞产生,在多种慢性炎症中有表达,是机体的重要免疫介质, IL-1可以引起TNF-α、IL-6、IL-8等炎性细胞因子的表达增高。有研究证实IL -1还可激活MAPK信号通路,从而启动NFKB和AP-1转录因子,以调控各种金属蛋白酶的数量和活性,其中MMP-9与干眼关系密切，它的过度表达可以影响角膜的重新上皮化。IL-1也可直接激活角膜上皮细胞中的MMP-9,且呈正反馈作用[16]。笔者团队推测，逍生散可能通过降低IL-1的产生，进而降低产生IL-6、TNF-α等炎症因子；以及逍生散可能通过降低IL-1的产生，激活MAPK信号通路进而调控MMP-9的数量和活性或者通过降低IL-1的产生而直接减少激活角膜上皮细胞中的MMP-9，发挥保护角膜上皮细胞、缓解干眼的作用。

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以上这些对人的能力、潜力的平等主义、乐观主义的思想，是增能理论的核心的理论基础，增能理论就是把每个人的内在力量、内在资源作为自己的核心理论基石。