肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中最常见的组织学类型，受遗传学和表观遗传学共同调控，DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，不仅在胚胎发育和细胞分化中起重要作用，而且在癌变过程中扮演了重要角色。在遗传学中将DNA甲基化异常的重要作用称为“肿瘤发生的第三条途径” [1]。

甲基化相关沉默目标-1(TMS1)是一种较新的CpG岛相关基因，也是一种新的抑癌候选基因，抑癌基因失活在肿瘤的发生、发展的过程中起着重要的作用。研究证明TMS1促进人类细胞的凋亡，多种恶性肿瘤中已检测到其表达减少或者缺失[2]。DNA甲基转移酶1(DNMT1)是一种甲基化关键酶，在催化和维持基因甲基化过程中发挥着重要的作用。DNA甲基化结构域2(MBD2)可以与甲基化的CpG岛结合，抑制基因转录和去甲基化，是介导DNA甲基化的重要因子。

为得知包含刚体原始位置信息的标准投影序列，只需要得知r0和θ0两个参数。因此可以简单采用Hough变换提取这两个参数[12]。根据式(5)，有

本研究主要通过检测肝癌组织及正常肝组织中TMS1、MBD2、DNMT1的蛋白表达水平及TMS1基因启动子的甲基化水平，探讨三者在HCC发生发展中的关系及相互作用，为其早期诊断、靶向治疗和判断预后提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集山东大学医学院2009年9月至2010年10月的患者外周血血清和手术切除组织，血清样本中HCC组34例、乙型肝炎组26例及健康者组23例；手术切除的HCC标本48例的肝癌组织、正常肝组织48例(距离肿瘤3 cm以上的肝组织)。48例HCC组中男38例，女10例，年龄27～78岁，中位年龄53.6岁。所有病例根据TNM分期标准进行分期，均有组织病理学诊断依据，-80 ℃冰箱保存。

1.2 免疫组织化学法检测 TMS1、MBD2和DNMT1蛋白表达组织蜡块连续切片，切片厚4 μm，置60 ℃烤箱中1 h。烤片68 ℃ 20 min。切片经二甲苯、梯度乙醇、PBS冲洗3遍。加50 μL 3% H2O2溶液，37 ℃放置10 min。微波抗原修复15 min自然冷却，PBS冲洗2遍。滴加50 μL一抗，37 ℃放置1 h，4 ℃冰箱孵育过夜。37 ℃静置1 h，PBS冲洗3遍。使用山羊超敏二步法试剂盒按照说明进行，滴加试剂1，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗2遍。滴加试剂2，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗2遍。滴加新鲜配制的DAB溶液，显色并观察。苏木素复染，脱水封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，细胞质内出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性染色。每张切片双盲计数至少5个高倍视野，阳性细胞数≥30%视为阳性表达，阳性细胞数<30%为阴性表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，采用χ2检验，以及Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 MSP检测TMS1基因启动甲基化状态 使用德国Qiagen公司DNA提取试剂盒并按说明书步骤操作提取血清基因组DNA。使用Berkmandu650分光光度仪测定核酸吸光度A260、A280，A260/A280>1.8。将DNA浓度稀释为1 μg/100 μL以进行修饰。使用美国Intergen公司CpGenome DNA修饰试剂盒并按照说明书的步骤操作进行DNA的亚硫酸氢钠修饰。PCR反应总体系25 μL，95 ℃ 12 min，94 ℃ 30 s，58 ℃(或60 ℃)30 s，72 ℃ 45 s，共45个循环，72 ℃ 10 min(TMS1引物序列见表1)。PCR产物置于3%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V 25 min，紫外光照显带。

 

表1 TMS1基因引物序列

  

基因引物序列(5'～3')退火温度(℃)大小(bp)TMS1/ASC-M-FTTG TAG CGG GGT GAG CGG C58191TMS1/ASC-M-RAAC GTC CAT AAA CAA CAA CGC GTMS1/ASC-U-FGGT TGT AGT GGG GTG AGT GGT60196TMS1/ASC-U-RCAA AAC ATC CAT AAA CAA CAC A

注:U表示非甲基化特异性引物；M表示甲基化特异性引物

目前财政资金的使用已经比较规范，虽然在实践上预算绩效管理的工作已经展开。但是，在预算编制、预算控制、预算绩效评价及考核应用多方面仍有许多不足。

2014年，青海水利工作将深入贯彻党的十八大、十八届三中全会和青海省十二次党代会精神，紧紧围绕加快水利改革发展主线和提高服务保障能力主题，努力实现全省水利发展“投资规模有增长、发展速度有提升、管理水平有提高、体制机制有活力、行业建设有形象”五大目标，为建设新青海、创造新生活提供水利保障。

2 结 果

2.1.1 TMS1、MBD2和DNMT1蛋白的免疫组化阳性表达率 48例肝癌组织、正常肝组织中，TMS1的阳性表达率分别为26.08%(10/48)、97.92%(47/48)，见图1；MBD2分别为18.75%(9/48)、80%(38/48)，见图2；DNMT1的阳性表达率分别为77.08%(37/48)、32.25%(15/48)，见图3。TMS1、MBD2在肝癌组织中的阳性表达率均低于正常肝组织，而DNMT1的阳性表达率高于正常肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)，TMS1、MBD2与DNMT1的表达均呈负相关(P<0.05)。

2.1 免疫组化结果

2.1.2 TMS1蛋白表达与临床病理学参数的关系 TMS1蛋白表达水平与年龄、性别无相关性(P>0.05)，与肿瘤的TNM分期、分化程度相关(P<0.05)，见表2。

 

注：A为肝癌组织；B为正常肝组织；C为左下方不着色的是肝癌组织，B为右上方着色的是正常肝组织；D为(同C)

图1 TMS1蛋白在HCC中的表达(×200)

 

注：A、B为肝癌组织；C、D为正常肝组织

图2 MBD2蛋白在HCC中的表达(×400)

 

注：A、B为肝癌组织； C、D为正常肝组织

图3 DNMT1蛋白在HCC中的表达(×400)

布鲁氏杆菌病由细胞内部寄生的病原菌引发，因此，普通的药物治疗无法获得理想的治疗效果[3]，可应用检疫或者淘汰的方法提前防治，以下有几种防治措施。

2.2 MSP检测TMS1基因启动子甲基化情况 TMS1在HCC组、乙型肝炎组和健康者组中的甲基化检出率分别为70.6%(24/34)、50%(13/26)、0%(0/23)，见表3，并随着肿瘤分级、分期的增加，其甲基化水平逐渐升高(P<0.05)，见图4。

 

表2 TMS1蛋白表达与临床病理学参数的关系

  

项目阳性例数(n)阴性例数(n)阳性率(%)P年龄 ≥50岁72521.880.801 6 <50岁31318.75性别 男83021.050.740 5 女2820分化程度 低1204.760.023 5 中41225 高56 45.45TNM分期 Ⅰ～Ⅱ81436.360.030 9 Ⅲ～Ⅳ2247.69

《触电》一诗中的意象，即得自这种“相去遥远的真实的遇合”。“握手”、“双手合十”这种手与手的接触与“烫伤”、“烙印”在现实中的关系很远，但正是由于这两组意象“真实的关系疏远”，给读者以强烈的感官冲击。但北岛的诗与超现实主义作品不同的是，超现实主义追求的是无秩序的自由想象而北岛的创作仍是基于理性。

 

注：MK为Mark；M为基因启动子发生甲基化，甲基化特异性引物可扩增出相应大小的条带；U为基因未发生甲基化，非甲基化特异性引物可扩增出相应大小的条带；阴为H2O作为阴性对照

图4 TMS1基因甲基化MSP产物琼脂糖凝胶电泳图像

在24例TMS1启动子甲基化的肝癌组织中，有22例同时伴有TMS1基因表达缺失，2例为阳性表达；在10例无启动子甲基化的肝癌组织中，有6例同时伴有TMS1基因表达缺失，4例为阳性表达。TMS1基因表达与其甲基化呈负相关(r=-0.64，P<0.05)。

HCC占我国原发性肝癌的90%以上，其恶性程度高、病情进展快，尽管目前采用手术、放疗、化疗和局部治疗为主的综合治疗措施，但大多数患者仍预后很差。目前研究发现人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化异常密切相关，而且在肿瘤发生的早期即可检测出，因此可作为肿瘤早期诊断的分子标志物、靶向治疗靶点和判断预后的手段。

 

表3 不同组别TMS1基因启动子甲基化检出率的比较

  

组别TMS1基因甲基化情况(n)+-合计(n)阳性率(%)健康者组023230.0乙型肝炎组13132650.0HCC组24103470.6

3 讨 论

随着城市的不断发展，市政工程建设也在如火如荼进行中，每天都有数以万计的市政工程在施工，以满足人们对基础设施建设的实际需要。市政工程是城市发展中不可缺少的物质基础，在建设的过程中只有保证了施工质量，才能提高市政工程的使用价值，其社会效益和经济效益都能实现，后期保养和维护难度也会减小。

TMS1是一个新发现的凋亡相关的抑癌候选基因[3-5]，由3个外显子组成,长1.5 kb,染色体的16p11.2～12.1上并α-编码一种22×103的CARD蛋白，根据TMS1的促细胞凋亡功能提示它可抑制肿瘤的发生，当其表达缺失时组织易发生癌变。目前在多种恶性肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等组织中已检测在TMS1基因的异常甲基化和TMS1蛋白表达下调甚至缺失，且与肿瘤的恶性程度密切相关。EMIETA等[6]研究发现TMS1功能的缺失是晚期肺癌进展以及转移的重要事件，并与肺腺癌的转移有着密切的关系。张志学等[7]研究认为TMS1基因甲基化可能是肺癌发生的早期事件，并且可能与吸烟有关，在肺癌中TMS1的甲基化与蛋白表达下降存在相关性，19例甲基化阳性的标本中有18例表现出蛋白表达下降。本研究结果与其相符，TMS1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率(26.08%，10/48)明显低于正常肝组织(97.92%，47/48)，TMS1蛋白表达水平与年龄、性别无相关性，而与肿瘤的TNM分期和分化程度相关(P<0.05)，证明肝癌中TMS1蛋白表达水平明显下降，并与肿瘤的发生、进展和浸润转移有密切的关系。

随着近年来PCR技术在遗传学检测中的广泛应用，PCR技术敏感性高、特异性高，而且操作简便、快捷，通过PCR技术对外周血血清中所提取得到的DNA进行基因甲基化检测，可以做到基本无创，该方法可用于HCC的早期筛查。

本研究应用MSP法检测外周血血清中TMS1基因的甲基化情况，其中肝癌组的甲基化检出率为70.6%(24/34)，乙型肝炎组为50%(13/26)，明显高于健康者组(0%，0/23)，其检出率随着肿瘤分级、分期的增加而升高；本研究发现在24例TMS1启动子甲基化的肝癌组织中，有22例同时伴有TMS1蛋白表达下降，在10例无启动子甲基化的肝癌组织中，有6例伴有TMS1蛋白表达下降。本实验证明肝癌中存在TMS1基因的异常甲基化并导致其蛋白表达下调，此现象在乙型肝炎患者中已经开始存在，而在健康人中未发生，证明TMS1的异常甲基化可能是HCC发生过程中的一个早期事件，并且可能与乙型肝炎病毒感染有关，这在HCC的恶性转化及肿瘤细胞的浸润转移过程中起着关键作用。

DNMT1是DNA甲基化过程的其中一个关键酶，其功能异常可引起多种抑癌基因的高甲基化。研究资料表明，DNMT1在肺癌和结肠直肠癌中阳性表达率明显高于正常组织，且与肿瘤细胞的低分化趋势有关[7-9]。本研究结果与国内外文献报道基本一致，DNMT1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率(77.08%，37/48)明显高于正常肝组织(32.25%，15/48)，证明DNMT1蛋白在肝癌中表达增加。高表达的DNMT1可通过促进抑癌基因的异常高甲基化导致肿瘤的发生。

DNA甲基化多发生在CpG二核苷酸上进而导致基因沉默，成为导致基因失活的重要机制之一。研究发现，MBD2在甲基化抑制转录和去甲基化作用中有不同的作用方式，其表达异常与肿瘤的关系密切，在不同的肿瘤中的表达不同[10-11]。在胃癌和结肠癌中MBD2因启动子甲基化修饰而表达下调，并随着结肠癌临床分期的演进而下调[12-15]。本研究发现，MBD2蛋白在肝癌组织中的阳性表达率(18.75%，9/48)明显低于正常肝组织(80%，38/48)，证明在HCC中存在MBD2基因的异常甲基化而导致其表达下调，其去甲基化酶和抑制基因转录的功能降低，导致抑癌基因TMS1的高甲基化无法逆转进而参与HCC的发生。

本研究发现，在HCC中TMS1基因高甲基化导致其蛋白表达率降低。TMS1、MBD2蛋白在肝癌组织中的表达率降低，而DNMT1蛋白的表达率增高，TMS1、MBD2与DNMT1的蛋白表达呈负相关。这表明HCC中TMS1基因的异常高甲基化，既可能是DNMT1高表达，其DNA甲基化酶作用增强，又有可能是MBD2蛋白表达下调，其抑制转录和去甲基化酶作用减弱，异常甲基化的TMS1无法被逆转等原因所致。因此有望通过抑制DNMT1的活性及增加MBD2的功能以恢复抑癌基因TMS1的表达，这对于为HCC的早期诊断治疗提供理论依据和防治的关键点。

综上所述，TMS1的异常甲基化可能是肝组织癌变的早期事件和频发事件，DNMT1、MBD2和TMS1蛋白的异常表达与HCC的发生、发展和浸润转移等过程有关，联合检测三者的表达情况，深入探讨其作用机制，对HCC的早期诊断、治疗和预后判断有重要价值，并可为肿瘤靶向药物的研发提供新的思路，提高临床的诊治水平。

参考文献

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