原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种原因不明的慢性胆汁淤积性自身免疫性疾病，好发于成年女性，确诊时往往已经发展到较严重的阶段。抗线粒体抗体(AMA)是诊断PBC的主要血清指标，有M1～M9共9个亚型，其中M2型AMA是PBC的特异性抗体[1]，M2型抗体的靶抗原为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复合体(2-OADC)的一些组分，2-OADC主要包括侧链二氧酸脱氢酶复合体E2亚基(BCOADC-E2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(PDC-E2)和 2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2亚基(OGDC-E2)。JIANG等[2]已成功应用基因工程的方法把3个线粒体表位共同表达，建立了检测AMA-M2的新方法。本实验采用另一种构建三联体表达载体的方法，不仅简化了操作步骤，而且达到预期的应用效果，有较好的临床应用价值。

产业风险评价体系的健全能帮助银行提高信贷业务的风险管理水平，因此在当前银行信贷业务的风险管理工作中，应对产业风险分析环节加以重视。针对当前银行信贷业务在进行产业风险评价时存在的不完善，建议从以下三个方面进行改进。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集深圳市第一人民医院确诊PBC患者的血清43例，其中男4例、女39例，年龄20～80岁，平均(44±15)岁，PBC诊断标准采用2000年美国肝病学会PBC指导建议[3]。收集同期自身免疫性肝炎(AIH)患者15例，乙型病毒性肝炎患者30例，丙型病毒性肝炎患者30例，类风湿关节炎(RA)患者33例，系统性红斑狼疮患者(SLE)32例，以及100例健康体检者的血清标本。

1.2 材料与试剂 将BCOADC-E2、PDC-E2和 OGDC-E2的基因拼接成三联体BPO，在5′端添加GST标签，由上海旭冠生物合成；限制性内切酶(EcoRI/XhoI)等主要工具酶及标记物购自于大连宝生物；表达载体pGEX-4T-1、DH5α和BL21由科室自存；小量胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、GST柱和Ni-NAT树脂柱购自于上海生工；抗M2-3E抗体检测试剂盒(ELISA)购自德国Euroimmun公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自Sigma公司；化学试剂均为分析纯，购自深圳化试科技有限公司。

1.3 仪器与设备 T100 PCR仪、Imark酶标仪、蛋白电泳仪和凝胶成像系统均购自美国BIO-RAD公司；DYY-8C核酸电泳仪由北京六一公司生产；Avanti J-E高速冷冻离心机由美国Beckman公司生产；ZHWY-211B全温型多振幅轨道摇床由上海智诚公司生产；VC505-750超声波细胞破碎仪由SONICS公司生产。

调查分为10个问题，围绕医学科学研究、数据库与大数据、数据挖掘类问题，见（表1）所示，问题回答级别0～10分，0分最低，10分最高。

因为调整土地过程中容易出现村社集体侵犯农民土地承包权的问题，以及寄希望于长久不变的土地承包权会提高农户对土地的投入水平从而提高农业产出，1998年前后进行的第二轮土地延包，将承包期再延长30年，并且规定不仅承包期内承包面积不得调整，而且承包地块也不得调整，2006年通过的《物权法》进一步将土地承包经营权确定为“用益物权”，从而极大地虚化了村庄集体的土地所有权。

1.4.1 引物的设计与合成 根据上海旭冠提供的含有目的基因的pUC19质粒，用Primer6.0软件设计用于大量扩增目的基因的引物。上游引物P1：5′-CCG GAA TTC GGT CAG GTT GT T CAG TTT-3′；下游引物P2：5′-CCG CTC GAG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGC TGC ACC GGT TTT ACG-3′；上述引物由上海生工合成。

2.1 目的基因的扩增 对含有目的基因的pUC19质粒进行PCR扩增。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增出的DNA片段在约1 500 bp处形成1条明亮的条带，与预期目的片段大小相符(图1)。

1.4.3 重组质粒的构建和转化 对纯化回收的PCR产物进行双酶切并与同样双酶切的载体pGEX-4T-1进行连接，37 ℃双酶切4 h，酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化回收；将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16 ℃连接过夜，构建含有目的基因的重组质粒pGEX-4T-1-BPO；将重组质粒再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；阳性克隆裂解后经PCR电泳鉴定，同时提取阳性克隆的质粒，进行双酶切验证。

1.4.4 蛋白表达及纯化 阳性重组菌大量培养后，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，IPTG终浓度为1 mmol/L，37 ℃通气培养4 h，4 ℃ 5 000 r/min离心15 min收集细菌，将细菌悬浮于20 mL蛋白质结合缓冲液；反复冻融数次，超声破碎菌体，4 ℃ 14 000 r/min超速离心20 min收集上清液，以获得表达菌液；带GST和HIS标签的表达蛋白溶液先后经GST柱和Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化。

对比于传统动力系统，混合动力系统能够实现多源提供动力，复杂程度更高，其配备的双向DC/DC变换器是电池工作模式下电能转换与传输的重要装置。当动车组工作于不同供电方式时，动车组运行性能很大程度上将受到双向DC/DC变换器和牵引逆变器组成的级联系统的稳定性的影响，因此对混合动力系统中双向DC/DC-逆变器级联系统的稳定性进行研究具有重要的意义。

2.2 重组表达质粒构建鉴定 构建好的重组质粒经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，得到与外源目的片段和pGEX-4T-1酶切片段大小相同的2条特异性条带(图2)。

1.4 方法

2.4 临床样本检测 ELISA方法检测326例临床血清AMA-M2，最佳Cut-off的OD值为0.52，样本的OD值与Cut-off的OD值比值大于1为阳性，比值小于1为阴性。其中43例PBC患者血清中，41例呈阳性；283例非PBC患者中，5例呈阳性；PBC组与非PBC组的AMA-M2检出率差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线下面积0.93，见图5，95%CI为(0.861，0.999)。

2 结 果

1.4.2 目的基因的扩增与纯化 以含有目的基因的pUC19质粒为模板，扩增目的基因；PCR扩增体系为50 μL，含有上、下游引物终浓度各0.2 μmol/L，dNTPs终浓度200 μmol/L，10×Buffer For Ex Taq 5 μL，模板2 μL，Ex Taq酶1.25 U，灭菌去离子水补足50 μL；按照94 ℃变性50 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min的程序扩增30个循环；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像系统观测并记录结果；在紫外灯下切下目的条带，用胶回收试剂盒提纯目的DNA。

 

注：1为BPO三联体PCR产物；M为DNA相对分子质量标志物

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

1.5 统计学处理 使用SPSS17.0分析软件；计数资料用例数和百分率表示，检出率差异比较采用χ2检验；采用ROC曲线计算三联体AMA-M2诊断PBC的最佳Cut-off值，并确定曲线下面积(AUC)、诊断特异度和敏感度。以P<0.05为差异有统计学意义。

 

注：1为双酶切鉴定结果；M为DNA相对分子质量标志物

图2 重组表达载体双酶切鉴定图

2.3 蛋白表达及纯化 SDS-PAGE结果表明，在蛋白质相对分子质量约为80×103处可见1条诱导表达的条带，与预期的相对分子质量一致(图3)；表达的目的蛋白占全菌蛋白的10%左右，亲和层析纯化后的蛋白质上清液在电泳凝胶上只显示融合蛋白的单一条带(图4)；经薄层扫描分析，纯化后的蛋白质纯度达95%以上。

1.4.5 间接ELISA方法建立及临床血清检测 纯化的重组蛋白用0.5 mol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.6) 稀释后包被酶标板，终浓度为10 μg/mL；4 ℃过夜，PBST洗涤3次后，加2%牛血清清蛋白(BSA)室温封闭16 h，洗涤后加入1∶100待检血清室温孵育60 min，洗涤后加1∶10 000辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温孵育30 min，然后洗涤3次，TMB避光室温显色10 min，终止后于450 nm读取光密度(OD)值；临界值为阴性对照OD平均值+3倍标准差。

 

注：M为蛋白相对分子质量标准；1为经IPTG诱导重组质粒转化菌；2为未经诱导重组质粒转化菌

图3 表达产物的SDS-PAGE分析

1.科研成果转化过程解析。通过对油田博士后已经完成和正在开展的科研项目的研究分析来看，从选题到启动研究到成果形成再到转化应用，最后见到效果，整个过程都有不同程度的转化行为，其转化过程大致分解为研究、形成和应用三个阶段，应用阶段包括推广传播、组织实施和效果产出三个环节。如图1所示。

 

注：M为蛋白相对分子质量标准；1为纯化的BPO蛋白

图4 重组BPO蛋白的纯化

  

图5 三联体AMA-M2诊断PBC的ROC曲线

3 讨 论

原发性胆汁性肝硬化是一种免疫介导的慢性炎症性胆汁性肝病，是最常见的自身免疫性肝病，患病率是自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎患病率总和的两倍以上[4]，并且逐年递增，2010年我国广州学者的研究显示，中国南部地区人群PBC 患病率为492/100 000，多为女性，目前研究认为每1 000位40岁以上女性中就有1位是PBC患者[5]。

AMA是PBC的血清标志物，95%的PBC患者可检测出AMA，10%～20%的自身免疫性肝炎患者呈AMA阳性，只有0.5%的健康人群有AMA[6]。有研究表明[7]，M2型AMA是检测PBC灵敏度最高的抗体，诊断灵敏度达94%，诊断特异度达95%以上。本实验结果显示，AMA-M2对PBC的诊断灵敏度和特异度略高于上述研究，分别为95.3%、98.2%，这主要与样本的选取有关。

美国加利福尼亚大学GERSHWIN等[8]于1987年鉴定出M2型抗体的靶抗原主要包括BCOADC-E2、PDC-E2和 OGDC-E2；本实验基于化学拼接法原理获得三联体基因，将多拷贝的基因片段一次性合成，形成一个完整的多拷贝基因片段，然后再以此为扩增模板，构建表达载体。JIANG等[2]使用的随机定向串联法，利用合成PCR引物，通过PCR获得1个拷贝的基因片段，通过限制性内切酶的黏性末端，将单拷贝基因经酶切后进行自身随机串联，该法只有将自身串联物克隆于载体后，经筛选来确定串联体中单体数目，而且除形成期望的串联体外，单体或串联体也可利用黏性末端自身环化，导致后续克隆失败，最终得不到串联体；两法相比较，本实验方法虽然基因合成的成本较高，但既简化了操作步骤，又可以避免三联体表达载体构建出错，因此更有优势。

部分商业化的ELISA试剂盒只是基于PDC-E2这个靶抗原设计的[9-10]，因此会导致PBC患者的漏检或者误诊。本实验应用三联体作为靶抗原，成功建立ELISA检测方法，对PBC均有较高的灵敏度和特异度，在保证特异度的同时也能有效地降低漏检率；据文献报道[11-12]，AMA对PBC的特异度并非100%，AIH、特发性血小板减少性紫癜和系统性硬化症等患者偶见AMA阳性，所以临床除了参考AMA-M2的结果外，还须结合生化指标进一步明确诊断。

参考文献

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[2]JIANG X H,ZHONG R Q,WANG X P,et al.Development of enzyme immune assay for detecting M2 autoantibody specific for primary biliary cirrhosis[J].Hepatobiiary Pancreat Dis Pnt,2003,2(2):290-294.

[3]HEATHCOTE E J.Management of primary biliary cirrhosis.The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines[J].Hepatology,2000,31(4):1005-1013.

[4]CAREY E J,ALI A H,LINDOR K D.Primary biliary cirrhosis[J].Hepatology,2015,50(1):291-308.

[5]POUPON R.Primary biliary cirrhosis:a 2010 update[J].J Hepatol,2010,52(5):745-758.

[6]BOGDANOS D P,INVERNIZZI P,MACKAY I R.Autoimmune liver serology:Current diagnostic and clinical challenges[J].World J Gastroenterol,2008,14(21):3374-3387.

[7]KAPLAN M M,GERSHWIN M E.Primary biliary cirrhosis[J].N Engl J Med,2006,353(3):313.

[8]GERSHWIN M,MACKAY I R,STURGESS A,et al.Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 kD mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis[J].J Immunol,1987,138(10):3525-3531.

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[10]MURATORI L,GRANITO A,MURATORI P,et al.Antimitochondrial antibodies and other antibodies in primary biliary cirrhosis:diagnostic and prognostic value[J].Clin Liver Dis,2008,12(2):261-276.

[11]PREUSS B,BERG C,DENGJEL J,et al.Relevance of the inner mitochondrial membrane enzyme F1F0-ATPase as an autoantigen in autoimmune liver disorders[J].Liver International,2012,32(2):249-257.

[12]ZOGRAFOS T,GATSELIS N,ZACHOU K,et al.Primary biliary cirrhosis specific auto-antibodies in first degree relatives of Greek primary biliary cirrhosis patients[J].World J Gastroenterol,2012,18(34):4721-4728.