罗汉松 Podocarpus macrophyllus（ Thunb.）D.Don是罗汉松科罗汉松属植物，广泛分布于热带、亚热带及南温带，其含有丰富的黄酮类化合物和萜类化合物，具有补中益气、祛风除湿的作用［1－3］。研究表明，罗汉松具有抗氧化、抗炎作用，并对血液和神经系统有良好的活性［4］。此外，罗汉松内生的真菌对寄主植物的病虫害具有一定的防御作用［5］。本研究以罗汉松果实的总黄酮含量为指标，采用单因素试验考察了不同的提取溶剂、提取时间、料液比对总黄酮含量的影响，再采用正交试验进一步优选最佳提取工艺，为进一步研究罗汉松提供了一定的参考依据。

On the Legal System of Eco-compensation for Natural Resources Conservation Wang Yi&Wang Haiyan

1 实验材料

1.1 仪器 DFT－1000高速万能打粉机（温岭市林大机械有限公司）；BP211D电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ5200B超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；优普纯水仪（上海优普实业有限公司）；UV－1780型紫外－可见分光光度计（日本岛津企业管理有限公司）。

1.2 试药 罗汉松药材来源于广西合浦县，经广西一心药业马利飞副主任中药师鉴定为罗汉松科植物罗汉松 Podocarpus macrophyllus（Thumb.）D.Don 的果实；芦丁（中国食品药品检定研究院，供含量测定用）；所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密称取罗汉松果实样品1 g，粉碎后过20目筛，置于50 ml锥形瓶中，加75%乙醇40 ml，称定其重量，超声60 min后放冷，再称定其重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取滤液1 ml，置25 ml量瓶中，加75%乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

由表3结果可见，在1∶10～1∶40范围内罗汉松果实总黄酮含量随着时间的增加而增大，而后随着提取溶剂用量的增大其含量逐渐减少，这可能与乙醇的用量有关，乙醇用量太大可能会导致一些醇溶性杂质增多，与黄酮类竞争同乙醇结合，导致总黄酮的溶解度下降，而使其含量减少。因此，选用 1∶10、1∶20、1∶40 的料液比为3个因素水平进行正交试验。

上元夜，灯节禁区。花千树，星如雨。火树银花不夜天，红男绿女人如潮。宝马雕车，脂香满路，皇后、贵妃、妃嫔、公主、郡主、贵妇人、娇小姐，个个穿红着绿，珠光宝气，空气都香得发腻，到处都是花粉气。

  

图1 芦丁标准曲线

2.4 单因素试验

2.5 正交试验

 

表1 不同溶剂对总黄酮提取量的影响 （mg/g）

  

编号 提取溶剂 总黄酮含量1 35%乙醇2 1.6762 55%乙醇 1.6987 3 4 75%乙醇 3.7875 95%乙醇 2.0100 5甲醇－水（1∶1） 3.6675 6甲醇3.6975

 

表2 不同提取时间对总黄酮提取量的影响 （mg／g）

  

编号 提取时间（min） 总黄酮含量1 30 2 3.8775 45 4.3950 3 4 60 4.3575 75 4.4925 5 904.3575

由表2结果可见，在一定的时间范围内，总黄酮的含量会随着时间的增加而略有增加，且在45～75 min范围内较为稳定，而在超声90 min后发现总黄酮的溶出量有所减少，这可能由于长时间进行超声处理，温度升高会破坏罗汉松果实中的总黄酮成分。因此，选取30 min、60 min、90 min 3个因素水平进行正交试验。

孔老一昨天上路前，吃了个肚子滚圆，还洗了澡，换了身干净的军服，只是军衔被剥夺了，领章处空荡荡的有些不习惯。老三被他细细擦拭干净，抹了香油，再用油纸里三层外三层包了个严严实实，最后用白布裹着，背在身后。他是戴罪之人，所以空着两手。

由表1结果可见，在6种不同的提取溶剂中，75%乙醇、甲醇－水（1∶1）和甲醇提取液中总黄酮的含量较其他提取溶剂提取的总黄酮含量高，乙醇经济易得，且比甲醇溶剂的毒性小，安全性比较高，因此选用乙醇作为考察溶剂。在35%～75%乙醇体积分数范围内，罗汉松果实含量随着乙醇体积分数的增加而增大，而后随着乙醇体积分数的增加而逐渐下降，这可能是由于过高的乙醇浓度会使溶剂极性降低，导致总黄酮的提取率下降，故选用55%乙醇、75%乙醇、95%乙醇3个因素水平进行正交试验。

2.4.3 料液比的考察 取罗汉松果实（过20目筛）6份，每份约1.0 g，精密称定，置于50 ml的具塞锥形瓶中，分别按照 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 的料液比加入75%乙醇，超声提取45 min，过滤，取滤液备用。精密量取1 ml供试品提取液置于25 ml容量瓶中，加入75%乙醇适量，按2.3项方法显色，并计算其含量，结果见表3。

对于Z向位移，0#承台1号、2号角点Z向最大位移约为-0.37 mm，3号、4号角点Z向最大位移约为-0.35 mm。承台的沉降差为0.02 mm，转角为0.0002°。1#承台1号、2号角点Z向最大位移约为-0.36 mm，3号、4号角点Z向最大位移约为-0.35 mm。承台的沉降差为0.01 mm，转角为0.0001°。承台沉降最大值约为-0.4 mm，转角最大约为0.0002°，左线隧道两侧的承台沉降差为0.02 mm。

 

表3 不同料液比对总黄酮提取量的影响 （mg/g）

  

编号 料液比 总黄酮含量1∶10 2 1 1.5675 1∶20 2.1100 3 1∶30 3.9825 1∶40 4.2400 5 1∶50 2.4375 4 6 1∶601.6650

2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10.40 mg，置于50 ml的容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，震荡摇匀，即得0.2080 mg/ml的芦丁对照品溶液。

2.4.1 提取溶剂的考察 取罗汉松果实（过20目筛）6份，每份约1.0 g，精密称定，置于50 ml的具塞锥形瓶中，并分别加入35%乙醇、55%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、甲醇－水（1∶1）、甲醇各 30 ml，超声 45 min，过滤，取滤液备用。精密量取1 ml供试品提取液置于25 ml容量瓶中，加入适量的提取溶剂，按2.3项方法显色，并计算其含量，实验结果见表1。

2.4.2 提取时间的考察 取罗汉松果实（过20目筛）5份，每份约1.0 g，精密称定，置于50 ml的具塞锥形瓶中，并分别加入75%乙醇30 ml超声提取30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，过滤，取滤液备用。精密量取1 ml供试品提取液置于25 ml容量瓶中，加入75%乙醇适量，按2.3项方法显色，并计算其含量，结果见表2。

2.5.1 水平因素 根据单因素考察的实验结果，选取乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为考察因素，以罗汉松果实中总黄酮含量为评价指标，对提取工艺进行优化，按照L9（34）正交表进行试验。因素水平见表4。

2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取0 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml、3.0 ml芦丁对照品溶液，置于25 ml容量瓶中，加入适量的甲醇，再依次加入亚硝酸钠溶液1 ml，放置6 min；硝酸铝溶液1ml，放置6 min；氢氧化钠溶液10 ml，定容至刻度。将溶液振荡均匀，放置15 min后在510 nm处检测吸光度，以相应的试剂作空白，以芦丁的浓度C（mg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程Y＝11.382 X－0.0076（r2＝0.9995），结果表明，芦丁在0.0099～0.0590 mg/ml范围内线性关系良好。见图1。

(2)镇痛泵通路护理：告知患者保持穿刺部位清洁干燥，注意观察穿刺部位有无红肿、疼痛。如果发生，要及时通知护理人员更换穿刺部位的敷料贴。同时要将导管和泵放置妥当，注意防止导管扭曲，尤其是在更换体位时要注意勿将导管拔出。

 

表4 水平因素表

  

因素水平A B C乙醇浓度（%） 提取时间（min） 料液比30 1∶10 1 55 2 75 60 1∶20 3 95901∶40

2.5.2 正交试验 精密称取罗汉松果实1 g，粉碎后过20目筛，置于50 ml锥形瓶中，按表5实验方案安排加入乙醇适量，称定其重量，超声一定时间后放冷，再称定其重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取滤液1 ml，置于25 ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。按2.3项方法显色，并计算其含量，结果见表5。方差分析见表6。

合村地处桐庐县西北角,受西北侧牛水坞山脉阻挡(图2),冷空气大风影响较弱,受东南侧龙门山脉影响,台风影响也较小,历史上产生的大风主要由强对流天气引起。距离廊桥约900 m的合村气象站建于2004年10月,通过对14a的气象资料分析,合村自动站历史上共出现过5次8级风、3次9级风,极大风速21.9 m/s。此次监测到极大风速24.1 m/s,为有气象记录以来最大。

由正交试验结果直观分析可知，各水平因素中，极差R最大的为A因素，其次为C因素、B因素，即乙醇浓度＞料液比＞提取时间。说明影响罗汉松果实总黄酮提取率最高的为A，其次为C、B。根据方差分析结果可知，A因素对提取的影响有显著意义，B因素、C因素对提取的影响无显著意义。根据各因素K的变化，A2＞A3＞A1、B2＞B1＞B3、C3＞C2＞C1，得出 A 因素和 B 因素应选择水平2，C因素应选择水平3，即A2B2C3。最终确定罗汉松果实总黄酮的最佳提取工艺条件为：A2B2C3，即采用75%乙醇超声提取60 min，料液比为1∶40。

 

表5 正交试验方案安排与结果

  

A B编号 乙醇浓度（%）D空白提取时间（min）C料液比总黄酮含量（mg／g）1 1 1 1 2 1 2 2 2 1.678 1 1.475 3 1 3 3 3 1.738 4 2 1 2 3 4.200 5 2 2 3 1 4.480 6 2 3 1 2 3.630 7 3 1 3 2 2.156 8 3 2 1 3 2.181 9 3 3 2 1 2.175 K1 1.630 2.610 2.429 2.710 K2 4.103 2.780 2.684 2.488 K3 2.171 2.514 2.791 2.706 R 2.4730.266 0.3620.222

 

表6 方差分析结果

  

注：F0.05＝19.0，F0.01＝99.0

 

因素 离偏差平方和 自由度 F A P 10.145 2 93.935 ＜0.05 B 0.108 2 1.000 C 0.208 2 1.926误差 0.11 2

2.6 验证试验 按最佳提取工艺条件进行平行试验3次，得出罗汉松果实的总黄酮平均含量为4.670 mg/g，高于正交试验中的其它组合，表明优选出的提取工艺合理可行。

3 讨 论

本研究通过单因素试验和正交试验考察提取溶剂、提取时间、料液比等因素对罗汉松果实总黄酮含量的影响，结果表明乙醇浓度是影响其含量的最主要因素，其次是提取时间和料液比。通过正交试验优选出罗汉松果实总黄酮的最佳提取工艺条件为：加入75%乙醇超声提取60 min、料液比为1∶40，在此条件下提取的罗汉松果实总黄酮含量为4.670 mg/g，表明优选出的最佳工艺可行，适用于工艺大生产。

罗汉松自然资源丰富，在民间及临床中应用广泛。通过查阅文献发现，目前对罗汉松果实有效成分的研究还较少，为保障用药的安全、合理及有效利用，本研究通过正交试验筛选出罗汉松果实中总黄酮的最佳提取工艺，为进一步开发罗汉松果实提供科学依据。

参考文献

［1］郑玉蓉，吴慧仪，潘素静，等.罗汉松叶中总黄酮的提取与纯化富集工艺研究［J］.广东药科大学学报，2017，33（1）：23－27.

［2］隗磊，周艳，谢云.不同浓度罗汉松果实醇提物调血脂及抗氧化的作用研究［J］.湖北中医药大学学报，2015，17（1）：57－59.

［3］冉雪琴，何映霞，孙端方，等.罗汉松内生真菌的抑菌活性研究［J］.中国畜牧兽医，2014，41（8）：219－223.

［4］张博.罗汉松属植物双黄酮成分及药理活性研究进展［J］.首都医药，2010，17（14）：67－69.

［5］王国平，王丽薇.一株罗汉松内生真菌及其活性代谢产物［J］.中国生物防治学报，2014，30（2）：287－292.