下咽癌是上消化道恶性程度最高的肿瘤之一,5年生存率仅为41.3%[1]。 造成较差预后的原因主要包括：发病位置隐蔽,症状出现较晚;生长方式呈侵袭性,易发生组织浸润;易出现淋巴结转移和远处转移[2]。 迄今,其发病机制尚不清楚, 导致针对下咽癌的分子治疗缺乏有效靶点。 研究发现,微小染色体维持蛋白7(minichromosome maintenance proteins 7,MCM7)具有调控细胞周期和细胞增殖等重要功能,与肿瘤发生发展关系密切[3-6],但MCM7 与下咽癌的关系还不清楚。 笔者利用分子生物学和生物信息学方法分析MCM7 在人下咽癌细胞系FaDu 中的表达及功能,并进一步分析MCM7 发挥作用的机制,以期为下咽癌的机制研究和治疗提供靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

从液氮中取出人下咽癌细胞系FaDu 后,迅速解冻,离心去上层清液。 置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM 培养基中,于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养,换液1 次/2 d。

自由基医学的飞速发展表明，自由基与癌症、衰老、各种心血管疾病、帕金森综合症等各种急性和慢性疾病密切相关[6]。刺玫果中含有大量的总黄酮黄酮,是具有自由基清除活性的天然抗氧化剂,必将在医学、药学、生物学、食品和材料等学科领域发挥更大的价值。

1.2 MCM7 在FaDu 中的表达检测

利用Real-time PCR 检测MCM7 在人下咽癌细胞系FaDu 中的表达。 培养生长状态良好的FaDu 细胞,48 h 后将目的细胞分入6 孔板培养,采用Real Time-PCR 的方法检测差异激酶基因的表达情况。根据Invitrogen 公司的Trizol 操作说明书进行总RNA抽提。 根据Promega 公司的M-MLV 操作说明书进行RNA 反转录获得cDNA。 MCM7 基因引物序列上游引物：5’-CTAGCTGTCTGCCCCTTGTC-3’;下游引物：5′-ACCGAGACAATGACCTACGG-3′;GAPDH 基因引物序列上游引物：5’-TGCTCCAACTCCTCCTCAG-3’;下游引物：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’;预变性95 ℃,15 s;之后每一步变性95 ℃,5 s;退火延伸60 ℃,30 s;共进行45 个循环。 每次在延伸阶段读取吸光值。 制作溶解曲线。 分析MCM7 与GAPDH 的比值以明确MCM7 在FaDu 中的表达情况。

1.3 FaDu 中MCM7 的基因沉默

利用购自赛默飞公司的MCM7-siRNA 沉默FaDu 中的MCM7 基因。 首先,利用250 μl 无RNA酶水溶解5 nmol MCM7-siRNA,获得20 μmol 的siRNA 母液。 同样方法制备对照组siRNA-NC 母液。转染前24 h 将细胞接种于6 孔板中。 然后,利用Opti-MEM I 稀释siRNA,待加入细胞及培养液后,终浓度达到50 nmol/L。 后续利用Western blot 和Real-time PCR 检测转染效果。

利用划痕实验证实MCM7 对FaDu 细胞迁移能力的影响。 首先,利用marker 笔和直尺于6 孔板后均匀划横穿过孔的横线,间隔1 cm,每孔至少5 条线。 向两个6 孔板中加入MCM7 沉默FaDu 细胞和对照组FaDu 细胞,每孔中加入6×105 个细胞。 第2天,用枪头垂直于孔板后横线划痕。 PBS 洗细胞3次,加入无血清培养基。 放入37 ℃含5%CO2 细胞培养箱中。 按0,6,12,24 h 取样后,拍摄照片。 利用Image J 软件对划痕进行定量分析。

“非遗”是社会文化资源的重要组成部分，也是社会文明进步的标尺。“非遗”传承、保护和开发必须遵循客观规律，不能无序传承和破坏性开发。政府和相关部门要分类研究项目传承保护的规律，做到分类布局、优选开发，要做好顶层设计、有序使用，确保“非遗”生态运行平衡和生态循环畅达。

1.4 划痕实验

Western blot：利用细胞裂解液提取实验组和对照组细胞的总蛋白,加热变性后10%SDS-PAGE 电泳分离,电转移至PVDF 膜上,用含5%脱脂奶粉的Tris 盐溶液封闭2 h,加入MCM7 一抗(1∶200),4 ℃孵育过夜。 用含吐温20 ℃的Tris 盐溶液洗膜(3次,10 min/次)后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000),室温下孵育1 h。 化学发光法(ECL)检测条带。 GAPDH 作为内参。 最后,利用Image J 软件进行蛋白表达条带的灰度值分析,并与内参灰度比较后计算灰度百分比。

1.5 MCM7 影响FaDu 细胞迁移能力的潜在机制分析

为了了解MCM7 影响FaDu 迁移能力的机制,笔者利用TCGA 数据库和生物信息学软件建立了MCM7 在头颈部鳞癌中的共表达基因网络,共包含48 个基因节点和231 条边。 详见图4。

1.6 统计学分析

我们知道，在伦敦，英国女王常住的是白金汉宫，偶尔度假会去温莎城堡，而荷里路德宫则是女王在爱丁堡的皇室住所。像白金汉宫等王宫一样，每当女王住在这里的时候，荷里路德宫就会升起皇家旗帜。

不仅如此，根据不同的媒介环境及时代背景因素，新闻叙事者的内涵也会随之发生变化。在传统新闻业中，记者、编辑及其所属机构占据于整个新闻叙事的主导地位，它们便是叙事者。而在大数据背景下，依托互联网及计算机技术产生的数据新闻中，叙事者则变得更为复杂。

2 结果

2.1 MCM7 在FaDu 中的表达

通过Real-time PCR 检测,明确MCM7 是否在FaDu 中表达。 结果显示FaDu 细胞中表达MCM7 基因。 详见图1。

  

图1 FaDu表达MCM7 基因

2.2 FaDu 中MCM7 的沉默效果

利用Western blot 和Real-time PCR 检测MCM7的沉默效果。 蛋白水平检测的结果显示与siRNANC 对照组相比,siRNA-MCM7 组中MCM7 蛋白的表达显著降低,P ＝0.003,如图2A 所示。 基因水平检测的结果显示与siRNA-NC 对照组相比,siRNAMCM7 组中MCM7 基因的表达显著降低, P ＝0.006,详见图2B。

  

图2 FaDu中，MCM7 的沉默效果检测

2.3 划痕实验

利用划痕实验探索MCM7 沉默对FaDu 细胞迁移能力的影响。 结果显示与对照组相比,MCM7 沉默后,FaDu 细胞的迁移能力受到明显抑制(P ＝0.011)。详见图3。

  

图3 划痕实验检测MCM7 沉默对FaDu 细胞迁移能力的影响

2.4 MCM7 影响FaDu 细胞迁移能力的机制分析

为了了解MCM7 影响FaDu 细胞迁移能力的机制,笔者利用癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA) 分析工具 Cbioportal(www.cbioportal.org)对279 例头颈部鳞癌患者的二代测序数据进行分析,进而筛选出与MCM7 发生共表达的基因,pearson 系数＞0.5 或＜-0.5。 然后,利用Cytoscape 软件(www.cytoscape.org)建立MCM7 共表达基因的互作网络。 最后,利用DAVID 数据库(www.david.ncifcrf.gov)分析MCM7 共表达基因的功能和通路(P＜0.05)。

  

图4 头颈部鳞癌中MCM7 的共表达基因网络

此外, 通过DAVID 数据库对这些基因所富集的通路进行分析,结果显示这些基因主要富集在细胞周期、DNA 复制和错配修复等通路(P＜0.05)。

数据采用SPSS 17.0 软件进行独立样本t 检验,各分组所得计量数据采用表示,P＜0.05 为差异有统计学意义。

 

表1 头颈部鳞癌中MCM7 的共表达基因网络的功能分析

  

功能(GO term) P GO：0006260～DNA replication 0.000 GO：0000082～G1/S transition of mitotic cell cycle 0.000 GO：0006281～DNA repair 0.000 GO：0000083～regulation of transcription involved in G1/S transition of mitotic cell cycle 0.004 GO：0042769 ～DNA damage response, detection of DNA damage 0.009 GO：0006351～transcription, DNA-templated 0.010 GO：0016569～covalent chromatin modification 0.011 GO：0007049～cell cycle 0.012 GO：0051573～negative regulation of histone H3-K9 methylation 0.024

 

(续表1)

  

功能(GO term) P GO：1900264 ～positive regulation of DNA-directed DNA polymerase activity 0.028 GO：0007059～chromosome segregation 0.031 GO：0000076～DNA replication checkpoint 0.032 GO：2000781 ～positive regulation of double-strand break repair 0.032 GO： 0006283 ～ transcription-coupled nucleotideexcision repair 0.036 GO：0006355 ～regulation of transcription, DNAtemplated 0.038 GO：0042127～regulation of cell proliferation 0.039 GO：0006310～DNA recombination 0.045

为了进一步明确这些共表达网络基因的功能,利用DAVID 数据库对这些基因的功能进行分析,结果显示网络功能包括DNA 复制、DNA 损伤修复、细胞周期调节、细胞增殖调节等(P＜0.05)。 详见表1。

3 讨论

下咽癌占下咽原发恶性肿瘤的95%,由于其发生部位隐蔽,且恶性程度高, 约50%的患者在确诊时已存在淋巴结转移,因此,预后较差,严重威胁人类生命健康[1,7]。 分子靶向治疗能够特异性地作用于特定肿瘤细胞,阻断其生长、转移或诱导其凋亡,从而抑制或杀死肿瘤细胞。 因此,成为21 世纪肿瘤治疗的主要方向和潮流。 但在下咽癌的分子靶向治疗领域中,由于其发病机制尚不清楚,尚缺乏有效的分子治疗靶点。 因此,探索能够调控下咽癌发生发展的重要基因靶点对于未来的下咽癌分子靶向治疗具有重要意义。

（6）根据实际情况制定安全防范措施。通预测危险因素，制定一套有效且有针对性的防范措施来预防安全事故的发生，对任务进行分解，指定专人落实。制定详细的“运维方案”，一定要确保现场勘察工作做到细致和全面，这对于运维过程实现安全管理是十分必要的。

持续性地分裂和繁殖是恶性肿瘤的一个显著特征。 微小染色体维持蛋白(MCM)家族在恶性肿瘤的DNA 复制调控过程中发挥重要作用,因此,成为近年来的研究热点。 MCM 家族主要包括MCM2、MCM3、MCM4 (CDC21)、 MCM5 (CDC46)、 MCM6(MIS5)以及MCM7(CDC47)等6 个亚单位。 研究表明,MCM 蛋白是一种重要的DNA 复制准许因子(RLF),能够规律性释放于DNA 复制的特定起点[8]。 在肿瘤G1 期开始时,MCM 蛋白能够在复制起始点经CDC45 蛋白作用与起始识别复合物(ORC)形成前复制复合物(pre-RCc)。 pre-RCc 被CDC7/DBF4 激酶活化后,能够参与肿瘤S 期的DNA 复制[9]。 因此,MCM 蛋白与恶性肿瘤的发生发展关系紧密,是肿瘤发病机制研究的重要切入点。

MCM 家族中,MCM7 是一类高度保守的蛋白质,被发现在酵母和真核细胞中表达。 研究证实,MCM7 与多种肿瘤的发生发展关系十分密切。 Lee等[10]发现MCM 蛋白之间可以互相作用并形成复合物,进而调节DNA 的复制和延伸。 其中, MCM4/6/7复合物可能是MCM 复合物的催化核心。 此外,在肿瘤表型与临床研究方面,Kim 等[11]发现MCM7 在膀胱癌中发生高表达并且能够促进膀胱癌细胞系肿瘤耐药性。 Zhong 等[12]发现MCM7 在食管鳞状细胞癌中高表达并且与预后呈显著负相关。 此外,研究人员还发现MCM7 与肝癌和前列腺癌的预后关系紧密[13-14]。 但是,MCM7 在下咽癌中的表达和作用还不清楚。 本实验, 笔者利用多种分子生物学方法发现MCM7 在下咽癌细胞系FaDu 中表达并发挥重要作用。

肿瘤细胞迁移能力的增强和下降预示肿瘤细胞向远处侵袭和转移能力的改变。 在沉默MCM7后, FaDu 的迁移能力显著下降,提示MCM7 可能提高了下咽癌的转移能力。 以上结果提示,MCM7 具有成为下咽癌发病机制和治疗新靶点的潜力,具有进一步研究的价值。 在了解MCM7 在下咽癌细胞系中的表达和作用后,利用TCGA 数据库和生物信息学方法进一步探索MCM7 影响FaDu 功能的潜在机制。 MCM7 是MCM 家族的重要成员之一,研究发现,MCM 家族成员具有类似的结构和功能,能够参与DNA 的复制,影响细胞的增殖和细胞周期[15],这些结果与本实验所得结果一致。 通过建立MCM7 在头颈部鳞癌中的共表达基因网络,发现MCM7 可能参与了DNA 的复制、DNA 损伤修复、参与了细胞周期调控以及细胞增殖的调节等。 在网络中,我们发现MCM7 和MCM3、MCM6 发生共表达,结合MCM蛋白家族的作用特征,提示MCM3、MCM6 和MCM7可能通过相互作用形成MCM 复合物来调控肿瘤的DNA 复制以及其他功能。 KEGG 通路富集分析发现MCM7 的共表达基因主要通过细胞周期、DNA 复制和错配修复等信号通路发挥作用。 这一结果进一步证实了MCM7 对于头颈部恶性鳞癌细胞的调节作用主要是通过调节DNA 复制相关功能来实现。 此外,MCM7 共表达网络中就有多个基因与肿瘤转移关系密切,例如研究发现CDK2 能够通过抑制肿瘤转移抑制因子BRMS1 来促进肿瘤转移[16],CDC6 能够抑制E- 钙黏蛋白的表达来促进肿瘤细胞发生上皮细胞间质化生(EMT)[17]。 这些结果提示在恶性肿瘤的DNA 复制过程中,MCM7 可能使一些肿瘤转移相关基因发生过度表达,进而导致肿瘤侵袭转移能力的增强。

本实验中,笔者通过分子生物学实验发现MCM7 在人下咽癌细胞系FaDu 中表达,并且影响FaDu 细胞的迁移能力。 通过进一步分析,发现MCM7 可能通过影响DNA 复制、细胞周期和细胞增殖等途径发挥功能。 本实验的结果能够为下咽癌的机制研究和分子靶向治疗提供新的切入点。

参考文献：

[1] NEWMAN J R,CONNOLLY T M,ILLING E A,et al. Survival trends in hypopharyngeal cancer： a population-based review[J]. Laryngoscope,2015,125(3)：624-629.

[2] MURA F,BERTINO G,OCCHINI A,et al. Surgical treatment of hypopharyngeal cancer： a review of the literature and proposal for a decisional flow-chart[J]. Acta Otorhinolaryngol Ital,2013,33(5)：299-306.

[3] YANG J Y,LI D,ZHANG Y,et al. The expression of MCM7 is a useful biomarker in the early diagnostic of gastric cancer[J]. Pathol Oncol Res,2018,24(2)：367-372.

[4] QU K,WANG Z,FAN H,et al. MCM7 promotes cancer progression through cyclin D1-dependent signaling and serves as a prognostic marker for patients with hepatocellular carcinoma[J]. Cell Death Dis,2017,8(2)：e2603.

[5] KANG W,TONG J H,CHAN A W,et al. MCM7 serves as a prognostic marker in diffuse-type gastric adenocarcinoma and siRNA-mediated knockdown suppresses its oncogenic function[J]. Oncol Rep, 2014,31(5)：2071-2078.

[6] ISHIBASHI Y,KINUGASA T,AKAGI Y,et al. Minichromosome maintenance protein 7 is a risk factor for recurrence in patients with Dukes C colorectal cancer[J]. Anticancer Res, 2014,34(8)：4569-4575

[7] FORASTIERE A A,ISMAILA N, LEWIN J S,et al. Use of larynx-preservation strategies in the treatment of laryngeal cancer： American society of clinical oncology clinical practice guideline update[J]. J Clin Oncol,2018,36(11)：1143-1169.

[8] GOZUACIK D, CHAMI M,LAGORCE D,et al. Identification and functional characterization of a new member of the human Mcm protein family： hMcm8[J].Nucleic Acids Res, 2003,31(2)：570-579.

[9] GOING J J,KEITH W N,NEILSON L,et al. Aberrant expression of minichromosome maintenance proteins 2 and 5, and Ki-67 in dysplastic squamous oesophageal epithelium and Barrett’s mucosa[J]. Gut, 2002,50(3)：373-377.

[10] LEE J K,HURWITZ J. Processive DNA helicase activity of the minichromosome maintenance proteins 4, 6, and 7 complex requires forked DNA structures[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(1)：54-59.

[11] KIM S H,HO J N,JIN H,et al. Upregulated expression of BCL2, MCM7, and CCNE1 indicate cisplatin-resistance in the set of two human bladder cancer cell lines： T24 cisplatin sensitive and T24R2 cisplatin resistant bladder cancer cell lines[J]. Investig Clin Urol,2016,57(1)：63-72.

[12] ZHONG X,CHEN X,GUAN X,et al. Overexpression of G9a and MCM7 in oesophageal squamous cell carcinoma is associated with poor prognosis[J].Histopathology,2015,66(2)：192-200.

[13] ZHOU Y M, ZHANG X F, CAO L, et al. MCM7 expression predicts post-operative prognosis for hepatocellular carcinoma[J]. Liver Int, 2012,32(10)：1505-1509.

[14] REN B,YU G,TSENG G C,et al. MCM7 amplification and overexpression are associated with prostate cancer progression[J].Oncogene, 2006,25(7)：1090-1098.

[15] SIMON N E, SCHWACHA A. The Mcm2-7 replicative helicase： a promising chemotherapeutic target[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014：549719.

[16] CALDON C E. Cdk2 regulates metastasis suppressor BRMS1[J].Cell Cycle, 2016,15(6)：779-780.

[17] ZHANG X,XIAO D,WANG Z,et al. MicroRNA-26a/b regulate DNA replication licensing, tumorigenesis, and prognosis by targeting CDC6 in lung cancer[J]. Mol Cancer Res, 2014,12(11)：1535-1546.